近紅外雙熒光系統(tǒng)在磷酸酯酶篩選中的應(yīng)用

楊昕霆 閻海霞 沈珝琲 張 業(yè)

奧德賽(Odyssey)近紅外雙熒光掃描系統(tǒng)是近年來引進(jìn)的一種新技術(shù)。近紅外雙熒光掃描系統(tǒng)的工作原理是使用激光激發(fā)帶有特殊標(biāo)記的抗體或者熒光染料，受激發(fā)的抗體或染料釋放出近紅外熒光，樣品發(fā)射出的700nm和800nm近紅外熒光信號可以被掃描儀器接收，并且計量近紅外熒光值，從而完成蛋白質(zhì)的定性或定量測量。這種測量方式可以精確測定局部的蛋白質(zhì)含量，并且可以通過計算總熒光量完成定性定量實驗。

KDM3A是JHDM2去甲基化酶家族中最早發(fā)現(xiàn)的成員，能夠去除組蛋白 H3K9的單甲基和雙甲基［1］。研究表明，KDM3A能夠影響精子的發(fā)生，參與脂肪代謝及多種癌癥的發(fā)生過程［2～4］。

近紅外雙熒光掃描系統(tǒng)可以完成多種蛋白質(zhì)定性定量實驗，尤其是在ICW(in cell western)中有著獨特的優(yōu)勢。本實驗初步證明了KDM3A能夠發(fā)生去磷酸化修飾，并且利用奧德賽近紅外雙熒光掃描系統(tǒng)初步篩選到4種PP1與PP2磷酸酯酶家族中可能參與蛋白KDM3A去磷酸化過程的磷酸酯酶亞基。

材料與方法

1．主要材料與試劑:磷酸化KDM3A抗體于MBL公司訂購。DRAQ5細(xì)胞核染料為Cell Signalling Technology產(chǎn)品。近紅外雙色熒光Phospho-EGFR Tyr104為LI-COR產(chǎn)品。轉(zhuǎn)染試劑Vigofect為威格拉斯生物技術(shù)公司產(chǎn)品。岡崎酸OA為Sigma公司產(chǎn)品。磷酸酯酶RNAi干擾文庫由哈佛醫(yī)學(xué)院Martin E．Dorf教授惠贈。

2．細(xì)胞系:HEK293T細(xì)胞系為本課題組保留。

3．細(xì)胞培養(yǎng):用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4．細(xì)胞轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染24h前接種HEK293T細(xì)胞，細(xì)胞匯合度達(dá)60%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)Vigofect轉(zhuǎn)染試劑說明書將磷酸酯酶干擾質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中。……