大孔樹脂法純化錦燈籠宿萼總黃酮的工藝

王曉林，薛健飛，陳 帥，王慧竹，鐘方麗

（吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022）

錦燈籠（Physalis alkekengi L.var.franchetii (Mast.)Makino）又名酸漿、紅姑娘、燈籠草，屬茄科植物酸漿的干燥宿萼或帶果實的宿萼。錦燈籠全草及果實均可入藥，具有清熱解毒、利咽、化痰、利尿作用，用于咽痛音啞、痰熱咳嗽、小便不利，其果實營養較豐富，果實果紅素可作食品著色劑。錦燈籠含有酸漿苦素類化合物、甾醇類、生物堿、氨基酸、黃酮類化合物和豐富的礦物元素及維生素[1-3]。已有學者對錦燈籠的化學成分進行了相關研究，結果表明酸漿苦素類化合物、黃酮類化合物是其主要的功效成分[4-6]。黃酮類化合物是一類重要的天然有機化合物，具有抗癌、抗心腦血管疾病、抗炎鎮痛、抑菌抗病毒、抗氧化和清除自由基等生理活性[7-10]，廣泛用于醫藥和食品領域。大孔吸附樹脂是一種多孔性、高比表面積高分子材料，對天然植物提取液中有機物質具有選擇性吸附作用，在天然產物活性成分的分離純化有廣泛應用[11-12]。本實驗對D-101型大孔吸附樹脂純化錦燈籠宿萼總黃酮的工藝條件進行優化，以期研究結果能為錦燈籠宿萼的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

錦燈籠宿萼 安徽省亳州市華申藥業有限公司；蘆丁對照品 中國食品藥品檢定研究院；水為重蒸餾水；大孔吸附樹脂（LSA-21、LSA-10、AB-8、LX-36、D-101、LSA-33） 西安藍曉科技有限公司；硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、無水乙醇等均為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

752 N型紫外-可見分光光度計、JY2002型電子天平上海精密科學儀器有限公司；RE-52A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D型循環水真空泵 河南省鞏義市英峪儀器一廠；CS101-AB型電熱鼓風干燥箱 中國重慶實驗設備廠。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制

精密稱取蘆丁對照品（120℃干燥至質量恒定）10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加入50%乙醇，制成蘆丁對照品溶液[13]（0.20 mg/mL）。精密吸取上述蘆丁對照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL分別置于50 mL容量瓶中，繪制標準曲線[14-15]，回歸方程為A=12C－0.001 83，R=0.999 9，結果表明蘆丁在0.008～0.048 mg/mL范圍內呈良好的線性關系。

1.3.2 樣品含量測定

取樣品液、吸附后液和解吸液適量，分別置于25 mL容量瓶中，按1.3.1節方法，以不加供試品的平行樣為空白，于510 nm[16-17]波長處測定吸光度，計算樹脂對錦燈籠宿萼總黃酮的吸附率、解吸率及浸膏總黃酮含量。計算公式如下[18-19]：

式中：C0為起始樣品液中總黃酮質量濃度/（mg/mL）；C1為吸附后溶液中總黃酮質量濃度/（mg/mL）；C2為解吸液中總黃酮質量濃度/（mg/mL）；V1為樣品液體積/mL；V2為解吸液體積/mL；m1為解吸液干燥后固體的稱樣量/mg；m2為解吸液中總黃酮的測定量/mg。

1.3.3 大孔吸附樹脂的預處理

稱取大孔吸附樹脂LX-36、LSA-33、LSA-10、D-101、AB-8、LSA-21各50 g加入玻璃柱內，按照文獻[20]進行預處理，樹脂處理完成后，置于密閉容器中，備用。

1.3.4 錦燈籠宿萼總黃酮樣品液的制備

稱取干燥的錦燈籠宿萼粉末適量，于圓底燒瓶中加入8倍量80%的乙醇溶液，熱回流提取2次，每次3.0 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至相對密度為1.18～1.25（60℃），蒸餾水定容至容量瓶中，待用[21]。

1.3.5 大孔吸附樹脂純化錦燈籠宿萼總黃酮工藝條件的確定

根據前期6種樹脂對錦燈籠宿萼總黃酮純化的篩選試驗數據，選用D-101型樹脂進行實驗。稱取2 g處理好的D-101型大孔吸附樹脂數份，分別置于數個干燥的100 mL具塞三角瓶中[22-24]，各加入20 mL已知質量濃度的錦燈籠宿萼總黃酮樣品液，進行吸附-解吸實驗，通過單因素試驗考察不同吸附時間（1、2、3、4、5、6、7 h）、樣品液不同pH值（4、5、6、7、8、9、10）對吸附率的影響，考察解吸液乙醇體積分數（10%、30%、50%、70%、90%）、解吸液用量（30、40、50、60、70、80 mL）、解吸時間（1、3、5、7、9、24 h）、樣品液不同pH值（4、5、6、7、8、9、10）對解吸率的影響[25]，在單因素試驗基礎上，對上述影響錦燈籠宿萼總黃酮純化的因素進行五因素四水平正交試驗，正交試驗因素水平如表1所示。

表1 正交試驗因素與水平Table1 Coded levels for independent variables used in orthogonal array design

1.3.6 工藝驗證實驗

稱取D-101型大孔吸附樹脂6 g，共3份，分別置于3個干燥的250 mL三角瓶中，同時分別吸取60 mL錦燈籠宿萼總黃酮樣品液（總黃酮質量濃度為1.171 8 mg/mL），用5% NaOH溶液調pH值為10，然后加到250 mL三角瓶內，振蕩吸附3 h，過濾，照1.3.1節的方法測定吸光度，計算吸附率。然后向過濾后帶有樹脂的3個三角瓶中各加入210 mL 80%的乙醇溶液，振蕩解吸7 h，按1.3.2節的方法測定溶液中總黃酮的含量，計算解吸率。再取50 mL總黃酮質量濃度為1.171 8 mg/mL的錦燈籠總黃酮樣品液、上述解吸液200 mL倒入稱量后的蒸發皿中水浴蒸干，然后放入到電熱鼓風干燥箱中干燥至質量恒定，計算錦燈籠宿萼干浸膏質量及浸膏中總黃酮的含量。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 吸附時間對吸附率的影響

圖1 吸附時間對吸附率的影響Fig.1 Effect of adsorption time on adsorption rate

如圖1所示：隨著吸附時間的延長，吸附率逐漸升高，當吸附時間達3 h，吸附率已達到了較高值，再延長吸附時間，吸附率基本不再提高，為了進一步考察吸附時間對吸附率的影響，選擇吸附時間為2.5、3.0、3.5、4.0 h進行正交試驗。

2.1.2 解吸液乙醇體積分數對解吸率的影響

圖2 解吸液乙醇體積分數對純化效果的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on purification efficiency

如圖2所示：隨著乙醇體積分數的增加，解吸率逐漸上升，當乙醇體積分數為70%時，解吸率達到最高值，為了進一步考察解吸液乙醇體積分數對解吸率的影響，選擇解吸液乙醇體積分數為50%、60%、70%、80%進行正交試驗。

2.1.3 解吸液乙醇用量對解吸率的影響

圖3 解吸液乙醇用量對純化效果的影響Fig.3 Effect of ethanol amount on purification efficiency

如圖3所示：隨著解吸液乙醇用量的增大，解吸率逐漸增大，當解吸液用量達到70 mL時，解吸率已達到較高值，再增加解吸液用量，解吸率增加較小，為了進一步考察解吸液用量對解吸率的影響，選擇解吸液用量為60、65、70、75 mL進行正交試驗。

2.1.4 解吸時間對解吸率的影響

圖4 解吸時間對純化效果的影響Fig.4 Effect of desorption time on purification efficiency

如圖4所示：隨著解吸時間的延長，解吸率逐漸升高，但當解吸時間達到7 h時解吸率已達到較高水平，再延長解吸時間，解吸率增加幅度較小，為了進一步考察解吸時間對解吸率的影響，選擇解吸時間為5、6、7、8 h進行正交試驗。

圖5 樣品液pH值對純化效果的影響Fig.5 Effect of sample pH on purification efficiency

2.1.5 樣品液pH值的影響

如圖5所示：吸附率隨pH值的升高而增大，解吸率略有下降，當樣品液pH值為7時，吸附率達到了77.58%，之后吸附率隨pH值的增大而緩慢提高，為了進一步考察樣品液pH值的影響，選擇樣品液pH值為7、8、9、10進行正交試驗。

2.2 正交試驗

表2 正交試驗設計及結果Table2 Orthogonal array design and results

根據單因素試驗結果，對影響錦燈籠宿萼總黃酮在D-101型大孔吸附樹脂上吸附與解吸的主要因素樣品液pH值、吸附時間、解吸液體積、解吸時間、乙醇體積分數按五因素四水平進行正交試驗，因素水平表見表1。稱取16份預處理好的D-101型大孔吸附樹脂，每份2 g， 分別置于16個干燥的100 mL具塞三角瓶中，各加入20 mL 1.181 3 mg/mL的錦燈籠宿萼總黃酮樣品液，用5% HCl溶液和5% NaOH溶液調pH值，然后進行靜態吸附和解吸實驗，收集吸附后藥液和解吸液，按1.3.2節方法測定吸光度，計算吸附率和解吸率，結果見表2。

由表2可知，D-101型大孔吸附樹脂純化錦燈籠宿萼總黃酮的最佳工藝條件為樣品液pH 10、吸附時間3 h、解吸液乙醇體積分數80%、解吸液體積70 mL（體積為樹脂質量的35倍）、解吸時間7 h。

2.3 工藝驗證實驗

為了檢驗正交試驗結果的可靠性，按優化的工藝條件進行3次驗證實驗，結果見表3。

表3 工藝驗證實驗結果Table3 Validation of the optimized purification conditions

由表3可知，3次驗證實驗的吸附率和解吸率分別為81.27%、82.42%、80.84%和86.26%、85.42%、87.16%，平均吸附率和解吸率分別為81.51%和86.28%，干浸膏中總黃酮含量由11.45%提高到45.56%。

3 結 論

對純化錦燈籠宿萼總黃酮的6種不同型號大孔吸附樹脂進行了篩選，并通過單因素和正交試驗研究了D-101型大孔吸附樹脂純化錦燈籠宿萼總黃酮的工藝條件。結果表明，在錦燈籠宿萼提取液pH值為10、吸附時間3 h、解吸液乙醇體積分數80%、解吸液體積70 mL（體積為樹脂質量的35倍）、解吸時間7 h條件下，D-101型大孔吸附樹脂純化錦燈籠宿萼總黃酮的吸附率和解吸率分別為81.51%和86.28%，純化后的干浸膏總黃酮含量由11.45%提高到45.56%。

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