蜂膠中多酚類成分分析及其抗氧化活性

張紅城，趙亮亮，胡 浩，董 捷*

（中國農業科學院蜜蜂研究所，國家農產品加工中心蜂產品加工分中心，北京 100093）

蜂膠是蜜蜂從膠原植物的嫩芽處采集的樹脂，并混入蜜蜂上顎腺的分泌物及蜂蠟、少量花粉等加工而成的，一種具有芳香氣味和黏性的膠狀固體物質[1]。蜂膠具有很多功能活性[2]，一群蜂一年內只能生產100～150 g蜂膠，因而蜂膠被譽為“紫色黃金”[3]。

蜂膠中主要活性成分是多酚類物質[4]，不同蜂膠因采集植物、蜜蜂種群、時間、地點等的不同[5-7]，其化學成分也不盡相同，導致其功能活性也會有一定的差異。許多研究表明蜂膠具有很好的抗氧化作用，與一些疾?。ㄈ绺哐?、糖尿病、老年癡呆癥等）的預防也有一定關系。近10 年來，氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）法被美國農業部、美國國立衛生院、美國宇航局等眾多科研機構認定為衡量食品抗氧化能力的標準分析方法。目前ORAC法已廣泛使用在評估食品的抗氧化能力上，但使用ORAC方法評估蜂膠體外抗氧化能力的研究卻很少。細胞模型能夠闡明細胞吸收、運輸和代謝中的一些問題[7]，因此為研究細胞水平抗氧化能力提供了一種經濟、快速的方法。

本實驗以9個蜂膠樣品為原料，采用超聲波輔助75%乙醇水溶液法進行提取。利用高效液相色譜-二極管陣列檢測器（high performance liquid chromatography-diode array detector，HPLC-DAD）檢測蜂膠中的多酚類成分，通過ORAC法和Hep G2細胞模型法評估不同地區蜂膠的抗氧化能力并研究蜂膠成分和抗氧化能力之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

9個蜂膠樣品由中國農業科學院蜜蜂研究所提供，分別來自河南新野（1號樣品）、河南拓城（2號樣品）、河北故城（3號樣品）、河北方城（4號樣品）、北京蜜蜂所（5號樣品）、北京延慶（6號樣品）、山西靈石（7號樣品）、黑龍江寶清（8號樣品）和甘肅天水（9號樣品），均由農業部蜂產業體系綜合試驗站的當地蜂場在2012年7—8月分別采集。將所有的蜂膠樣品置于－20℃條件下冷凍，待其變硬變脆后，快速轉移到中草藥粉碎機粉碎，粉碎后置于封口袋，－70℃冷凍貯存，待用。

3,4-二羥基苯甲醛、咖啡酸、香蘭素、p-香豆酸、阿魏酸、異阿魏酸、苯甲酸、蘆丁、3,4-二甲氧基肉桂酸、楊梅酮、肉桂酸、桑色素、短葉松素、槲皮素、山姜素、山奈酚、亞桂皮乙酸、芹菜素、異鼠李素、松屬素、柯因、咖啡酸苯乙酯、高良姜素、山奈素、球松素、柚木柯因、肉桂酸肉桂酯、香草酸、4-甲氧基肉桂酸、水楊苷、水楊醇、水楊酸等，均為色譜純；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、無水乙醇，均為分析純；Trolox、熒光素（fluorescein，FL）、偶氮二異丁脒鹽酸鹽（2,2’-azobis（2-methylpropionamide）dihydrochloride，ABAP）、封板膜、噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）、細胞培養級二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA） 美國Sigma公司；5-甲氧基短葉松素、短葉松素-3-乙酸酯 實驗室自制；甲醇（色譜純） 美國Fisher公司；甲基化-β-環糊精 比利時Acros公司；DMEM高糖培養基、磷酸鹽緩沖液Hanks洗液 北京索萊寶科技有限公司；0.25 g/100 mL胰酶-EDTA消化液 美國Gibco公司；6孔、96孔細胞培養板 美國Corning-Costar公司；Hep G2（人肝癌細胞株） 中國科學院細胞庫。

1.2 儀器與設備

WK-600A高速粉碎機 青州市精誠醫藥裝備制造有限公司；AL204型分析天平 瑞士梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；Milli-Q Intergral純水/超純水一體化系統 美國Merk Millipore公司；KQ-50DB型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；微量移液器、5417R型冷凍離心機 德國Eppendorf公司；HZS-H型水浴搖床 哈爾濱市東明醫療儀器廠；SY21-K型電熱恒溫水浴鍋 北京長風儀器儀表公司；LGJ-12真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；LC-6AD高效液相色譜儀（配有二極管陣列紫外檢測器，CTO-10A柱溫箱，SIL-自動進樣器，LCsolution數據處理系統）日本島津公司；RE-2000A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；Synergy TM HT型多功能酶標儀 美國Biotek公司；HERA-Cell 150CO2培養箱 美國Thermo公司；IX71型熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司；Cell QuantaTM流式細胞儀（488 nm激光） 美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂膠75%乙醇提取物的制備

準確稱取500 mg已粉碎的蜂膠樣品，置于50 mL已稱重的具塞錐形瓶中，分別加入10 mL 75%乙醇。40℃、100 r/min水浴搖床中提取24 h。每6 h取出錐形瓶并于超聲波清洗器中，超聲1 h，共超聲4次。提取結束后，離心收集不同蜂膠提取液。之后取500 μL置用甲醇稀釋7.5倍，經0.22 μm微孔膜過濾，待用。

1.3.2 混合標準品溶液配制

準確稱取一定質量的標準品，用色譜甲醇將其超聲溶解，將其配制成一定濃度的標準品儲備液。根據各種標準品的出峰時間及強度，進行相應的混合。利用混合標準品工作液進行下面的色譜定性和定量分析。

1.3.3 HPLC的分析條件

Shim-Pack PREP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；柱溫：35℃；檢測波長：280 nm；流速：0.65 mL/min；進樣量10 μL；流動相：B相，甲醇（含0.1%乙酸）；A相，0.1%乙酸水溶液。所用的梯度洗脫程序如下：0～10 min，25%～27% B；10～45 min，27%～37% B；45～58 min，37%～49% B；58～80 min，49% B；80～125 min，49%～72% B；125～150 min，72%～85% B[8-10]。

1.3.4 樣品中各組分的定量

取上述配制的混合標準品工作液，按1.3.3節色譜條件，分別以1、5、10、15、20、25 μL進樣量，依次進樣分析。以對照品的進樣量（X，μg/L）對峰面積Y進行線性回歸分析，得出各個組分的標準曲線。由標準曲線分別計算出各個產地蜂膠中各組分的含量?？傸S酮含量是指已定量的黃酮類成分的含量總和；總酚酸含量是指已定量的醛類、酚酸及其酯類成分的含量總和；總多酚含量是指已定量所有成分的含量總和。

1.3.5 ORAC值測定

吸取20 μL的稀釋后的樣品液或空白液（緩沖液）或者Trolox標準物質溶液（6.25、12.5、25、50、100 μmol/L）加入至96 孔板（熒光測定專用）中，于每個加樣孔中加入150 μL濃度為8.16×10-2μmol/L熒光素（FL）溶液，覆膜，然后在37℃酶標儀中孵育10 min。最后加入30 μL 153 mmol/L ABAP（自由基產生劑）啟動反應，迅速覆膜，使用熒光酶標儀進行測定。酶標儀測定條件為：激發波長485 nm，發射波長528 nm，首先振蕩5 s，然后測定，每分鐘測定1次，總測定時間為50 min[11]。

ORAC值采用美國農業部的單位，即μmol Trolox當量/100 g樣品。ORAC值越高，代表其抗氧化能力越強。

抗氧化能力= AUC抗氧化劑－AUC空白

熒光衰退曲線下面積（area under the curve，AUC）可以通過采用近似積分法計算，根據Wu等[11]實驗中采用的公式得出。

1.3.6 MTT法檢測蜂膠對Hep G2細胞的毒性

收集對數期Hep G2細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入200 μL，鋪板使待測細胞調密度1 000～10 000/孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。每組設5個平行樣，于體積分數為5% CO2、37℃培養箱中培養使其貼壁；除去培養液，加入新的培養液與不同濃度的蜂膠提取液，于5%CO2，37℃孵育20 h；棄去培養液，小心用PBS沖2～3 遍后，再加入含MTT的培養液，每孔加入20 μL MTT溶液（即0.5% MTT），繼續培養3 h；終止培養，小心吸去孔內培養液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。使用酶標儀在570 nm波長處測量各孔的吸光度。

1.3.7 通過細胞模型測定蜂膠的抗氧化活性

取對數生長期的Hep G2細胞，調整細胞懸液濃度接種于6 孔細胞培養板，每個孔加入1 mL細胞懸液。于37℃、5% CO2培養箱培養24 h后去掉原培養液，用預冷的PBS清洗1次；加入10 mg/mL蜂膠溶液誘導30 min，之后去掉培養基用預冷的PBS清洗一次；加入5 mmol/L H2O2刺激30 min，去掉培養基后用預冷的PBS清洗1次；加入20 μmol/L DCFH-DA溶液，5% CO2、37℃培養箱中繼續培養30 min，棄去培養液，用預冷的PBS溶液清洗3次，以充分洗去未進入細胞內的探針。最后收集v細胞并制成細胞懸液，用流式細胞儀檢測熒光強度，激發波長為488 nm，發射波長為525 nm。

2 結果與分析

2.1 9個蜂膠樣品中多酚類化合物組成和含量比較

圖1 不同地區蜂膠的HPLC色譜圖Fig.1 Comparative HPLC chromatogram fingerprints of propolis extracts from different geographic origins

由圖1可知，保留時間70 min之前，蜂膠提取物中主要成分是酚酸類物質，包括咖啡酸、p-香豆酸、異阿魏酸和3,4-二甲氧基肉桂酸等；在70～100 min之間主要成分是黃酮類物質，包括松鼠素、短葉松素-3-乙酸酯、柯因等；而100 min之后主要是球松素、高良姜素等黃酮和咖啡酸苯乙酯和肉桂酸肉桂酯等酚酸酯類物質。

表1 蜂膠提取物中多酚類成分含量Fig.1 Contents of polyphenols in propolis extracts

通過與標準品的保留時間、紫外光譜進行對比鑒定，對蜂膠樣品中的24種多酚類成分進行了定性定量分析，結果如表1所示。蜂膠75%乙醇提取物中主要是一些多酚類成分，包括黃酮、酚酸及酯類物質，其中河南新野（1號）和黑龍江寶清（8號）的蜂膠樣品中總多酚含量比較高，分別是230.078 mg/g和228.18 mg/g；河南拓城（2號）蜂膠樣品中的總多酚含量最低只有81.91 mg/g。此外，總酚酸含量最高的是黑龍江寶清的蜂膠，其次是河北方城（4號），分別是54.87 mg/g和42.53 mg/g；總黃酮含量最高的是來自河南新野的樣品，達到了194.52 mg/g。

在9個樣品中，含量較高的黃酮成分包括短葉松素-3-乙酸酯、松屬素、柯因、短葉松素、高良姜素、5-甲氧基短葉松素。含量較高的酚酸及酯類成分有咖啡酸苯乙酯、p-香豆酸、咖啡酸、異阿魏酸。 Claudio等[12]檢測來自于亞洲地區的各蜂膠樣品，其中含量較高的黃酮有柯因、松屬素、短葉松素-3-乙酸酯和高良姜素，這與本研究結果相近。此外，不同產地的蜂膠的成分存在一定的差異，如p-香豆酸在來自河南拓城和河北故城（3號）的蜂膠中的含量較其他產地的蜂膠中的要高；3,4-二甲氧基肉桂酸在來自河北方城、北京延慶（6號）和黑龍江寶清（8號）的蜂膠樣品中的含量較其他蜂膠樣品中的多。

表2 蜂膠提取物的ORAC評估Fig.2 ORAC values of propolis extracts

2.2 9個蜂膠樣品的ORAC值比較

由表2可知，各蜂膠提取物的ORAC值都很高，高于美國農業部公布的所有樣品的ORAC值[13]，說明蜂膠提取物的抗氧化能力非常強。由表還可看出這9種蜂膠樣品的ORAC值范圍為261 021～842 096 μmol Trolox/100 g。Daugsch等[14]也測定了烏拉圭蜂膠的ORAC值，其范圍約為180 000～900 000 μmol Trolox/100 g，其結果與本實驗結果相近。結合表1和表2可知，抗氧化能力最強的是來自黑龍江寶清的樣品，其對應的總酚酸的含量也是最高的，達到54.87 mg/g；而山西靈石的ORAC值最低，其總酚酸的含量為21.06 mg/g，也是所有樣品中總酚酸最低的。此外河北方城和北京延慶蜂膠的抗氧化能力在所有樣品中分別為第二和第三，其總酚酸的含量也是對應的相同的位置。因此可知總酚酸含量較高的蜂膠，其ORAC值也普遍較高。蜂膠的ORAC抗氧化能力可能與酚酸類物質的含量存在一定關系。

2.3 Hep G2細胞模型法研究蜂膠的抗氧化活性

2.3.1 MTT實驗檢測不同質量濃度蜂膠的細胞毒性

圖2 不同質量濃度蜂膠的細胞毒性Fig.2 Cytotoxicity of different concentrations of propolis on Hep G2 assayed by MTT test

活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與活細胞數成正比。二甲基亞砜能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀在570 nm波長處測定其吸光度，可間接反映活細胞數量。圖2反映的是經不同質量濃度（0、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL）的蜂膠處理后的細胞存活情況，吸光度越大表示活細胞數量越多。經空白、6.25、12.5、25 μg/mL蜂膠處理后，其吸光度差異不大，即細胞存活數基本一致，說明當蜂膠質量濃度低于25 μg/mL，并不能致死細胞；當蜂膠質量濃度達到50 μg/mL時，吸光度開始明顯下降，活細胞數降低，說明蜂膠在該質量濃度下可致死細胞。因此在之后的實驗中，為了能更好地反映蜂膠在細胞中的作用，實驗中蜂膠提取物質量濃度應低于25 μg/mL。

2.3.2 流式細胞儀檢測蜂膠的細胞內抗氧化活性

圖3 9個蜂膠樣品對Hep G2細胞內活性氧的影響Fig.3 Effect of propolis extracts on reactive oxygen species (ROS) in Hep G2 cells

圖3表示的是9個蜂膠樣品處理Hep G2細胞后，通過流式細胞儀檢測細胞內活性氧變化情況。當Hep G2細胞用過氧化氫處理后，過氧化氫與細胞內部的DCFH反應，產生具有綠色熒光的DCF。通過流式細胞儀測定細胞內DCF熒光強度，可以反應出細胞內的活性氧的水平。對于陽性樣品，即不用蜂膠樣品處理細胞，其細胞內活性氧的含量很高，，其陽性細胞率和總熒光強度分別達到了96.40%和221 104（圖3c）。當細胞經蜂膠樣品處理后，細胞內的活性氧都有不同程度的降低，即相比于不加蜂膠的對照樣，其陽性細胞比例和總熒光強度都有明顯的下降，說明這些蜂膠樣品在細胞內都表現了一定的抗氧化能力。黑龍江寶清、北京蜜蜂所、甘肅天水這3種蜂膠樣品處理后的熒光強度降低的最明顯，都降到空白的一半以下，說明這3種蜂膠的細胞內抗氧化能力是最強的。其中，黑龍江寶清的蜂膠樣品，細胞內的活性氧減少的最多，即細胞內大量的活性氧被該蜂膠樣品清除，其陽性細胞比例為16.90%，與對照相比降低了79.5%，總熒光強度由之前的221 104變為77 651，降為原來的1/3（圖3f），表明黑龍江寶清的蜂膠樣品細胞內抗氧化能力最強。這與之前的ORAC實驗結果一致，這說明細胞模型法和體外ORAC法測定蜂膠的抗氧化能力的結果具有一定的相似性。而河北故城和河南拓城的蜂膠細胞內抗氧化能力很低。其中經過河北故城的蜂膠樣品處理后，其清除活性氧的效果不明顯，陽性細胞比例和總熒光強度分別為85.20%和159 311，與對照相比差別不大，說明其清除活性氧的效果不明顯，其細胞內抗氧化能力是這幾種蜂膠樣品相比是最弱的。總之從實驗結果可知，9個蜂膠樣品在細胞內均表現出一定的抗氧化能力。

細胞內抗氧化能力的強弱與ORAC法測定的細胞外抗氧化的結果有一定的相關性，但也存在一定的差異。兩種方法顯示黑龍江寶清的樣品在體外和體內的抗氧化能力都是最強；而河北故城的蜂膠在處理細胞后，細胞內的活性氧降低得最少，但其總熒光強度也有一定程度的降低，說明也有一定的抗氧化能力，與ORAC法測定得到其抗氧化能力是非常強的結果不相符，這可能是河北故城蜂膠樣品中有一部分活性成分沒有進入細胞內發揮抗氧化作用，從而導致細胞外的抗氧化能力強，而細胞內的抗氧化能力弱。此外，北京蜜蜂所和甘肅天水的樣品ORAC抗氧化能力較低，而在細胞實驗中的結果則顯示較高。此二者中總酚酸含量低導致了體外的抗氧化能力低，而它們的總黃酮的含量相對來說較高。因此推測蜂膠的細胞內抗氧化能力可能與黃酮類成分有關。黃酮類成分與酚酸類成分相比可能更容易進入細胞內，從而發揮抗氧化的作用，但具體機理需進一步研究。

3 結 論

通過HPLC對9個蜂膠中多酚類成分進行定性和定量分析。實驗結果顯示，9個蜂膠樣品的主要多酚類成分是黃酮、酚酸和酯類物質。黃酮類化合物含量較高的有短葉松素-3-乙酸酯、松屬素、柯因、短葉松素和高良姜素；酚酸及酯類物質含量較高的有咖啡酸苯乙酯、p-香豆酸、咖啡酸和異阿魏酸。利用ORAC法和細胞模型研究了這9個蜂膠樣品的抗氧化活性性，結果表明這些蜂膠樣品都具有很強的抗氧化能力。但不同的蜂膠因含有多酚類成分及含量的差異，表現出的抗氧化能力也存在一定差異。一般來說，總酚酸含量高的樣品具有比較高的體外ORAC抗氧化能力。在細胞模型中，總酚酸和總黃酮含量都高的樣品，細胞內抗氧化能力強；蜂膠的細胞內抗氧化能力可能與黃酮類成分有關?？傮w來說，蜂膠具有較強的體外和細胞水平的抗氧化能力。

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