糖譜法比較不同產(chǎn)地竹蓀多糖結(jié)構(gòu)特征

吳定濤，巨瑤君，陸靜峰，趙 靜，李紹平*

（澳門大學(xué)中華醫(yī)藥研究院，中藥質(zhì)量研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，澳門 999078 ）

長(zhǎng)裙竹蓀（Dictyophora indusiata）隸屬于擔(dān)子菌亞門、鬼筆科、竹蓀屬，被譽(yù)為“菌中皇后”，是我國(guó)著名的食用菌[1-3]?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，多糖作為長(zhǎng)裙竹蓀的主要活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力[4]，抑制腫瘤和癌細(xì)胞生長(zhǎng)[5-6]，抗氧化[7-9]等活性。實(shí)際上，多糖的生物活性與其單糖組成及比例、糖苷鍵類型及順序、分子質(zhì)量、粒徑、溶液鏈構(gòu)象等密切相關(guān)[10-12]。因此，為評(píng)價(jià)長(zhǎng)裙竹蓀質(zhì)量，對(duì)其多糖進(jìn)行比較研究是十分必要的。然而，由于多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，目前尚無比較不同產(chǎn)地長(zhǎng)裙竹蓀多糖的報(bào)道。

高效凝膠排阻色譜聯(lián)用多角度激光光散射（high performance size exclusion chromatography coupled with multi-angle laser light scattering，HPSEC-MALLS）能夠準(zhǔn)確測(cè)定多糖分子參數(shù)，包括重均分子質(zhì)量（molecular weight，Mw）及其分布、回旋半徑以及溶液鏈構(gòu)象等，并已成功用于香菇多糖[13]注射液質(zhì)量評(píng)價(jià)。另外，糖譜法是我們提出的一種多糖定性定量分析方法[14-17]，糖譜法聯(lián)用熒光輔助凝膠電泳（polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis，PACE）已成功應(yīng)用于不同來源靈芝多糖、天然蟲草多糖、北蟲草多糖以及手掌參多糖的質(zhì)量研究[18-22]。本研究將結(jié)合使用HPSECMALLS和糖譜法聯(lián)用PACE比較研究長(zhǎng)裙竹蓀多糖結(jié)構(gòu)特征，提高竹蓀多糖及其產(chǎn)品質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四川宜賓（樣品DI1）、福建莆田（樣品DI2）、四川青川（樣品DI3、DI4、DI5、DI6）共6批來至不同產(chǎn)地長(zhǎng)裙竹蓀由無限極（中國(guó)）有限公司提供，經(jīng)鑒定為Dictyophora indusiata (Vent.Pers.) Fisch.子實(shí)體。

右旋糖酐酶（E C 3.2.1.1 1）、α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）和果膠酶（EC 3.2.1.15） 美國(guó)Sigma公司；昆布二糖（95%）、昆布三糖（95%）、昆布四糖（95%）、昆布六糖（95%）、β-1,3-葡聚糖苷酶（EC 3.2.1.39）、β-葡聚糖苷酶（EC 3.2.1.6）、β-2,1-菊粉酶（EC 3.2.1.7） 愛爾蘭Megazyme公司；8-氨基1,3,6-萘三磺酸二鈉鹽 日本東京化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社；聚丙烯酰胺凝膠 美國(guó)伯樂公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

微波輔助提取儀 奧地利安東帕公司；凝膠電泳分析儀 美國(guó)伯樂公司；凝膠成像系統(tǒng) 英國(guó)Syngene公司；多角度激光光散射、示差檢測(cè)器 美國(guó)懷亞特公司；紫外檢測(cè)器（diode array detector，DAD）、高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技公司；凝膠排阻色譜柱（TSK Gel G6000pwxl和TSK Gel G3000pwxl） 日本東曹公司。

1.3 方法

1.3.1 微波輔助提取長(zhǎng)裙竹蓀多糖

樣品經(jīng)干燥、打粉后，采用微波輔助提取儀制備長(zhǎng)裙竹蓀子實(shí)體粗多糖。分別取1 g樣品進(jìn)行提取，提取條件為微波功率500 W，溫度120℃，提取時(shí)間15 min，料液比1∶20（m/V）。隨后將提取液濃縮至10 mL，加入4倍體積的乙醇（體積分?jǐn)?shù)95%）沉淀粗多糖。沉淀再用去離子水復(fù)溶，高速離心去除水不溶物后，低壓冷凍干燥機(jī)凍干上清液，獲得長(zhǎng)裙竹蓀多糖。

1.3.2 長(zhǎng)裙竹蓀多糖HPSEC圖譜構(gòu)建和分子質(zhì)量及其分布測(cè)定

采用美國(guó)懷亞特示差檢測(cè)器（refractive index detector，RID）測(cè)定長(zhǎng)裙竹蓀多糖比折光指數(shù)增量值（dn/dc），即取粗多糖10 mg，配制成終質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的水溶液各3 mL，樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，采用RI-batch模式測(cè)得長(zhǎng)裙竹蓀多糖dn/dc值為0.145 mL/g。

采用HPSEC-MALLS/RI構(gòu)建長(zhǎng)裙竹蓀多糖HPSEC圖譜及測(cè)定分子質(zhì)量分布，并聯(lián)用DAD在線檢測(cè)樣品UV280 nm吸收。色譜條件：流動(dòng)相為0.9 g/100 mL的氯化鈉水溶液；色譜柱柱溫35℃；流速0.5 mL/min；色譜柱TSK Gel G6000pwxl串聯(lián)TSK Gel G3000pwxl；樣品質(zhì)量濃度約為2.5 mg/mL；進(jìn)樣量100 μL；采用Astra 6軟件收集及處理數(shù)據(jù)。

1.3.3 長(zhǎng)裙竹蓀多糖PACE特征性糖譜構(gòu)建

1.3.3.1 長(zhǎng)裙竹蓀多糖精制

取長(zhǎng)裙竹蓀多糖凍干粉末各20 mg，溶于10 mL去離子水中，采用分子截留量為3 000 D的離心超濾管處理樣品，即高速離心超濾（4 000×g，25 min），并重復(fù)上述過程步驟5次，以去除樣品中分子質(zhì)量低于3 000 D小分子化合物，再采用苯酚-硫酸法測(cè)定總多糖含量[23]，以調(diào)節(jié)用于酸和酶催化水解的多糖樣品量。

1.3.3.2 長(zhǎng)裙竹蓀多糖部分酸水解

取超濾處理后的多糖溶液200 μL（約0.5 mg）若干份，加入1.5 mol/L三氟乙酸100 μL，混勻。隨后將混合液置于80℃保溫5 h。反應(yīng)結(jié)束后，采用氮吹干燥儀干燥酸水解產(chǎn)物，并加入適量甲醇清洗水解產(chǎn)物，以去除水解產(chǎn)物中殘留的三氟乙酸，干燥產(chǎn)物用于后續(xù)衍生化處理；另以不加三氟乙酸水解的長(zhǎng)裙竹蓀多糖溶液為空白對(duì)照作平行處理。

1.3.3.3 長(zhǎng)裙竹蓀多糖酶水解

取超濾處理后的多糖溶液200 μL（約0.5 mg）若干份，分別加入右旋糖酐酶、β-1,3-葡聚糖苷酶、β-葡聚糖苷酶、果膠酶、α-淀粉酶和β-2,1-菊粉酶至終濃度為2、2、2、20、20、2 U/mL，隨后將混合液置于40℃保溫12 h。反應(yīng)結(jié)束后，將混合液置于80℃保溫20 min，終止酶催化水解。采用高速離心去除變性后的酶蛋白，隨后在35℃條件下氮吹干燥上清液，獲得多糖酶解產(chǎn)物。另以不添加糖苷水解酶長(zhǎng)裙竹蓀多糖溶液作為空白對(duì)照。另分別取右旋糖酐70、燕麥葡聚糖、可溶性淀粉、聚半乳糖醛酸各0.5 mg，分別加入右旋糖酐酶、β-葡聚糖苷酶、α-淀粉酶和果膠酶在上述相同條件下反應(yīng)，酶水解產(chǎn)物作為陽性對(duì)照。最后，酶水解產(chǎn)物按之前報(bào)道的方法進(jìn)行衍生化處理[18-19]后分析。

1.3.3.4 長(zhǎng)裙竹蓀多糖水解產(chǎn)物電泳分析

熒光輔助凝膠電泳按報(bào)道的方法[18-19]進(jìn)行。即采用垂直板凝膠電泳分離多糖部分酸水解、酶水解產(chǎn)物，分離膠和濃縮膠分別為0.1 mol/L Tris-boric（pH 8.2）配制的30 g/100 mL和8 g/100 mL的聚丙烯酰胺凝膠。電泳緩沖液為0.1 mol/L Tris-boric（pH 8.2）。上樣量為1～3 μL，首先采用200 V進(jìn)行電泳分離20 min，隨后采用700 V進(jìn)行電泳分離45 min。所有的樣品均至少重復(fù)電泳分析3次。凝膠在UV365 nm條件下成像。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Quantity-One 軟件（版本4.6.2，美國(guó)伯樂公司）掃描PACE凝膠圖上各條帶光密度值，生成電子掃描特征圖譜，隨后采用計(jì)算機(jī)輔助相似性評(píng)價(jià)系統(tǒng)（版本1.290，由中南大學(xué)中藥現(xiàn)代化研究中心及香港理工大學(xué)開發(fā)）創(chuàng)建各電子掃描特征圖譜共有模式圖譜并計(jì)算各特征圖譜與共有模式圖譜之間的相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)裙竹蓀多糖HPSEC圖譜及分子質(zhì)量分布

多糖分子質(zhì)量及其分布、粒徑、溶液鏈構(gòu)象等與多糖的生物活性密切相關(guān)[10]，并且多糖溶液鏈構(gòu)象已被用于多糖的質(zhì)量控制研究[13,22]。因此，本研究采用HPSECMALLS構(gòu)建不同產(chǎn)地長(zhǎng)裙竹蓀多糖HPSEC圖譜，并準(zhǔn)確測(cè)定其分子質(zhì)量及分布，研究結(jié)果有利于提高長(zhǎng)裙竹蓀多糖的質(zhì)量控制。不同產(chǎn)地長(zhǎng)裙竹蓀多糖HPSEC圖譜見圖1，重均分子質(zhì)量及其分布見表1。結(jié)果表明不同產(chǎn)地長(zhǎng)裙竹蓀多糖HPSEC圖譜中均有相似的色譜峰，色譜峰1和2基本無紫外吸收，其分子質(zhì)量及其分布也類似（表1）。由于S E C柱分離能力較弱，分子質(zhì)量相對(duì)較小的化合物（分子質(zhì)量小于5 000 D）均在36.5～40.0 min之間洗脫，結(jié)果導(dǎo)致色譜峰3分子質(zhì)量不能準(zhǔn)確測(cè)定（誤差＞15%）。

圖1 不同產(chǎn)地長(zhǎng)裙竹蓀多糖HPSEC色譜圖（dRI信號(hào)和UV 280 nm吸收）Fig.1 HPSEC chromatograms of polysaccharides in D.indusiata collected from different places of China

表1 不同產(chǎn)地長(zhǎng)裙竹蓀多糖分子質(zhì)量及其分布Table1 Molecular weights and their distribution of polysaccharides from D.indusiata

2.2 長(zhǎng)裙竹蓀多糖部分酸水解產(chǎn)物特征糖譜

圖2A表明各長(zhǎng)裙竹蓀多糖樣品在水解前不含小分子糖類化合物。不同產(chǎn)地長(zhǎng)裙竹蓀多糖的部分酸水解產(chǎn)物PACE特征圖譜基本一致（圖2B）。此外，采用Quantity-One軟件采集PACE特征圖譜中各條帶光密度值，構(gòu)建部分酸水解產(chǎn)物掃描圖，并用計(jì)算機(jī)輔助相似性評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算部分酸水解產(chǎn)物掃描圖共有模式圖譜，同時(shí)計(jì)算各樣品與共有模式之間相似度。結(jié)果：不同產(chǎn)地長(zhǎng)裙竹蓀多糖部分酸水解產(chǎn)物與其共有模式之間的相關(guān)系數(shù)值見表2，平均相關(guān)系數(shù)值為0.957±0.039（n = 6），提示不同產(chǎn)地長(zhǎng)裙竹蓀多糖具有相似的部分酸水解特征。然而酸水解選擇性差，特異性酶水解有利于研究長(zhǎng)裙竹蓀多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)特征。

表2 長(zhǎng)裙竹蓀多糖與其共有模式相關(guān)系數(shù)Table2 Correlation coefficient of each sample of D.indusiiaattaa to their simulative mean chromatogrraamm

2.3 長(zhǎng)裙竹蓀多糖酶水解產(chǎn)物特征性糖譜

糖譜法是針對(duì)多糖結(jié)構(gòu)特征建立的一種特異性強(qiáng)、選擇性高的表征多糖化學(xué)特征性圖譜的新方法[14]，糖譜法聯(lián)用PACE具有高效分離能力和高通量處理能力等優(yōu)勢(shì)[18-19]，并且熒光標(biāo)記檢測(cè)具有很高的靈敏度，明顯優(yōu)于常用的示差檢測(cè)器和蒸發(fā)光檢測(cè)器[10]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用糖譜法結(jié)合PACE方法分析比較不同產(chǎn)地長(zhǎng)裙竹蓀多糖6種酶水解產(chǎn)物，PACE特征性圖譜見圖3。結(jié)果表明：不同產(chǎn)地長(zhǎng)裙竹蓀多糖均能被β-1,3-葡聚糖苷酶（圖3A）、β-葡聚糖苷酶（圖3B）、α-淀粉酶（圖3C）、右旋糖酐酶（圖3D）、β-2,1-菊粉酶（圖3E）以及果膠酶（圖3F）催化水解成小分子糖類化合物，說明長(zhǎng)裙竹蓀多糖含有β-1,3-葡萄糖苷鍵，β-1,4-葡萄糖苷鍵，α-1,4-葡萄糖苷鍵，α-1,6-葡萄糖苷鍵、β-2,1-果糖苷鍵和α-1,4-半乳糖醛酸苷鍵等。此外，長(zhǎng)裙竹蓀多糖α-淀粉酶水解產(chǎn)物與可溶性淀粉水解產(chǎn)物不同（圖3C），且長(zhǎng)裙竹蓀多糖對(duì)碘-碘化鉀試液不顯色，說明長(zhǎng)裙竹蓀多糖中的α-1,4-葡萄糖苷鍵不是源自淀粉類化合物。表2總結(jié)了不同產(chǎn)地長(zhǎng)裙竹蓀多糖酶解產(chǎn)物與其共有模式之間的相關(guān)系數(shù)值，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)不同產(chǎn)地長(zhǎng)裙竹蓀多糖十分相似（平均相關(guān)系數(shù)值均大于0.95）。

圖3 不同產(chǎn)地長(zhǎng)裙竹蓀多糖酶解產(chǎn)物PACE特征性圖譜Fig.3 PACE fingerprints of enzymatic hydrolysates of polysaccharides from D.indusiata

3 結(jié) 論

不同產(chǎn)地長(zhǎng)裙竹蓀多糖具有很高的相似性，長(zhǎng)裙竹蓀多糖含有β-1,3-葡萄糖苷鍵，β-1,4-葡萄糖苷鍵，α-1,4-葡萄糖苷鍵，α-1,6-葡萄糖苷鍵、β-2,1-果糖苷鍵和α-1,4-半乳糖醛酸苷鍵等。本研究結(jié)果有利于表征竹蓀多糖的化學(xué)特征，提高長(zhǎng)裙竹蓀多糖質(zhì)量控制。

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