大花羅布麻不同部位酚類物質含量及其抗氧化活性比較研究

韓愛芝，黃軍海，孟慶艷，劉 文，白紅進,*

（1.新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護與利用重點實驗室，塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2.上海醫藥工業研究院張江研發中心，上海 200040）

大花白麻為夾竹桃科（Apocynaceae）白麻屬大花羅布麻（Poacynum hendersonii（Hook.F.）Woodson），新疆維吾爾族稱其為“野務其干”“陶格其干”等[1]。它在我國北方部分省區都有分布，如新疆、青海和甘肅等，新疆有豐富的野生羅布麻資源，主要分布在羅布泊、塔里木河、孔雀河畔及阿克蘇地區。羅布麻為多年生宿根草本植物，是荒漠綠化與防風沙的優良種植物[2]。《本草綱目》中記載，羅布麻的藥用價值極高，其根、莖、葉、花、全草入藥，能平肝安神、清熱利水，用于治療肝陽眩暈、心悸失眠、浮腫尿少、高血壓、神經衰弱、腎炎浮腫，1977年羅布麻被正式錄入《中華人民共和國藥典》[3-4]。現代文獻研究證明，羅布麻含有多糖、酚類與鞣質、黃酮、有機酸、生物堿、蒽醌、氨基酸和人體所需的微量元素等多種藥物成分，進一步研究黃酮類物質的化學結構，為槲皮素和異槲皮素苷、蘆丁、山萘酚等，對頭暈癥狀、改善睡眠質量有明顯效果，尤其對高血壓、高血脂、有較好的療效，同時具有增強免疫、預防感冒、平喘止咳、消除抑郁、活血養顏、解酒護肝、降解煙毒、軟化血管、通便利尿等生理保健功效[5-7]。

多酚在植物體中的存在形式有3種：游離態、酯化態和結合態，有的文獻也將游離態和可溶性的酯化態合稱為游離態[8]。據Bonolim[9]、Holtekjolen[10]等報道，植物中游離酚多以原花青素、類黃酮類為主，酯化酚、結合酚多為酚酸類為主，結合酚與葡萄糖、纖維素、木質素、類黃酮、蛋白質、酒石酸等結合的形式存在于植物組織的初生壁和次生壁中。各植物組織中，酚的存在形式和含量都不盡相同，而且在不同的發育階段，各植物組織中酚的存在形式和含量也會發生相應的變化。

目前人們對羅布麻的有效成分及生理功能研究較多[11-12]，但對其各部位中的多酚存在形式、組分含量及抗氧化活性的研究較少。本實驗以塔里木盆地大花白麻全株為試材，分別對其根、莖、葉、花中多酚存在形式及其抗氧化活性進行對比研究，揭示不同部位大花白麻多酚物質的分布、存在特點，以期為該植物的品種選育、人工栽培與產品加工質量控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆羅布麻全株，于2012年7月上旬采自新疆阿拉爾，由塔里木大學植物科學學院邱愛軍副教授鑒定為白麻屬大花羅布麻（Poacynum hendersonii（Hook.F.）Woodson），按照根、莖、葉、花分開后陰干，粉碎置于4℃貯藏備用。

蘆丁對照品（批號：60922） 德國Dr.Ehrdnstorfer公司；Trolox 美國Sigma公司；福林酚 北京九州天瑞科技有限公司；沒食子酸 上海山浦化工有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

RE-50B旋轉蒸發儀 上海申生科技有限公司；LXT-ⅡB大容量離心機 上海安亭科學儀器廠；KQ-400KDE臺式通用超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司； BS124S電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；水浴鍋 上海申生科技有限公司；CARY-100紫外-可見分光光度計 澳大利亞Varian公司；FW-100高速萬能粉碎機 北京市永光明醫療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 游離態酚類物質提取

參照徐元元等[13]的方法提取游離態酚類物質，得游離態酚類提取液（簡稱游離酚），于－18℃保存備用，每個樣品平行提取3次。

1.3.2 結合態酚類物質提取

參照徐元元等[13]的方法提取結合態酚類物質，得結合態酚類提取液（簡稱結合酚），在－18℃保存備用，每個樣品平行提取3次。

1.3.3 多酚的定性實驗

三氯化鐵-鐵氰化鉀反應、三氯化鐵反應、香草醛-鹽酸反應。

1.3.4 黃酮的定性實驗

鹽酸-鎂粉反應、三氯化鋁反應、氨熏實驗。

1.3.5 總酚含量的測定

1.3.5.1 沒食子酸標準曲線的繪制

參照Chiremba等[14]的方法，采用Folin-Ciocalteu比色法測定吸光度。擬合的回歸方程為：y=0.011 5x－0.005 6（R2=0.999 1），式中：y為吸光度，x為沒食子酸質量濃度/（μg/mL），樣品檢測質量濃度在10～100 μg/mL范圍內與吸光度線性關系良好。

1.3.5.2 樣品總多酚含量測定

各取大花羅布麻根、莖、葉與花的提取液1 mL，按照1.3.5.1節的方法測其相應吸光度，計算總多酚含量，結果以100 g干樣品中所含沒食子酸當量（gallic acid equivalent，GAE）表示，簡寫為mg GAE/100 g干質量。重復3次測定。

1.3.6 總黃酮含量的測定

1.3.6.1 蘆丁標準曲線的繪制

1.3.6.2 樣品總黃酮含量測定

各取大花羅布麻根、莖、葉與花的提取液1 mL，按照1.3.6.1節的方法測其吸光度，計算總黃酮含量，結果以100 g干樣品中所含蘆丁當量（rutin equivalent，RE）表示，簡寫為mg RE/100 g。重復3次測定。

1.3.7 DPPH自由基清除能力

各樣品對DPPH自由基清除能力參照Li Wu等[15]的方法，略有改動。將1 mL 提取液與3 mL 0.052 mg/mL DPPH自由基的甲醇溶液反應，用力振搖混勻后置暗室中靜置30 min，測定反應液在517 nm波長處的吸光度。以甲醇代替樣品作為空白對照，實驗以Trolox作為標樣制作標準曲線，得回歸方程：y=－0.001 7x+0.856 5（R2=0.999 7），式中：y為吸光度，x為Trolox質量濃度/（μg/mL）。樣品清除DPPH自由基能力以100 g干樣中所含Trolox的當量微摩爾數表示（μmol Trolox/100 g）。重復3次測定。

1.3.8 ABTS+?清除能力

參照Shahwar等[16]方法，制備ABTS+?儲備液，測定樣品對ABTS+?清除能力。于734 nm波長處測其吸光度，以甲醇作為空白。實驗以Trolox作為標樣制作標準曲線，得回歸方程：y=－0.002 5x+0.683 4 （R2=0.999 6），式中：y為吸光度，x為Trolox質量濃度/（μg/mL）。樣品清除ABTS+?的能力結果以100 g干樣中所含Trolox的當量微摩爾數表示（μmol Trolox/100 g）。重復3次測定。

1.3.9 總還原力測定

本研究涉及體院排球隊5名最高水平男運動員(接應、副攻、2名主攻、二傳)，運動員在比賽中的場上位置及需要采集分析的相關參數見表1。自由人不在其中，因為其在比賽中不參與發球、進攻與攔網。

參照Kumarl等[17]的方法，略有改動。取樣品稀釋液1 mL與pH 6.6、0.2 mol/L的磷酸緩沖溶液2.5 mL和1 g/100 mL鐵氰化鉀溶液2.5 mL混勻，50℃水浴保溫20 min，加入10 g/100 mL的三氯乙酸2 mL終止反應。搖勻，5 000 r/min離心5 min。吸取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.1 g/100 mL三氯化鐵溶液0.5 mL避光反應30 min后在700 nm波長處測定吸光度，以蒸餾水代替樣品作為空白。實驗以L-抗壞血酸作為標樣制作標準曲線，得回歸方程：y= 0.004 7x+0.177 5（R2=0.999 5），式中：y為吸光度，x為VC質量濃度/（μg/mL）。樣品結果以100 g干物質中所含VC的當量微摩爾數表示（μmol VC/100 g）。重復3次測定。

1.4 統計方法

2 結果與分析

2.1 大花羅布麻不同部位總多酚與總黃酮的定性實驗結果

2.1.1 總多酚定性實驗結果根據植物化學成分系統預試，由表1可知，大花羅布麻葉、根、花、莖含有多酚類化合物。

表1 總多酚類定性實驗Table1 Qualitative tests of phenolics

2.1.2 總黃酮定性實驗結果根據植物化學成分系統預試，由表2可知，大花羅布麻葉、根、花、莖含有黃酮類化合物。

表2 總黃酮類定性實驗Table2 Qualitative tests of flavonoids

2.2 大花羅布麻不同部位總多酚含量的測定結果

表3 不同部位游離態多酚、結合態多酚和總酚的含量（±s，n==33）Table3 Cntennts of free, bound and total phenolics in different parts(±s,, n == 33))

表3 不同部位游離態多酚、結合態多酚和總酚的含量（±s，n==33）Table3 Cntennts of free, bound and total phenolics in different parts(±s,, n == 33))

注：以干質量計；同列字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。下同。

含量/（mg GAE/100 g） 游離態多酚占總多酚比例/%游離態多酚 結合態多酚 總多酚葉 6 273.23±123.02a 13.45±6.14b 6 286.68±129.16a 99.79根 5 028.79±47.21b 19.56±0.17ab 5 048.35±47.38b 99.61花 4 279.03±60.34c 16.14±1.54ab 4 295.17±61.88c 99.62莖 3 560.19±109.58d 22.01±2.99a 3 582.2±112.57d 99.39不同部位

由表3可知，羅布麻不同部位的游離態多酚和總酚含量有顯著差異。樣品中游離態多酚含量遠大于結合態多酚含量，且游離態多酚含量介于（3 560.19±109.58）～（6 273.23±123.02）mg GAE/100 g之間。游離態多酚占總酚比例為99.39%～99.79%。其中游離態多酚含量最高的是羅布麻葉，高達（6 273.23±123.02）mg GAE/100 g，結合態多酚含量最高的是羅布麻莖，達（22.01±2.99）mg GAE/100 g。總酚含量從大到小的順序依次為：葉＞根＞花＞莖，可見葉中總酚含量顯著高于其他部位。總酚含量的降低趨勢與游離態多酚的一致，這是由于游離態多酚占總酚含量的99%以上，即羅布麻不同部位多酚主要以游離態多酚為主。

2.3 大花羅布麻不同部位總黃酮含量的測定結果

由表4可知，羅布麻不同部位的游離態黃酮、結合態黃酮和總黃酮含量有顯著差異，提取的酚類化合物中總黃酮含量在（1 106.81±5.54）～（2 516.80±296.02）mg RE/100 g，不同部位的游離態黃酮、結合態黃酮和總黃酮含量有顯著差異。樣品中游離態黃酮含量遠大于結合態黃酮含量，并且游離態黃酮含量介于（1 080.30±4.94）～（2 488.21±295.56）mg RE/100 g之間。游離態黃酮占總黃酮比例為97.61%～99.52%。其中游離態黃酮含量最高的是羅布麻根，高達（2 488.21±295.56）mg RE/100 g，結合態黃酮含量最高的是根，達（28.59±0.46）mg RE/100 g。總黃酮含量從大到小的順序依次為：根＞葉＞花＞莖，且提取物中的黃酮類物質以游離態為主要存在形式。

表4 不同部位的游離態黃酮、結合態黃酮和總黃酮的含量（±s，n==33）Table4 Contents of free, bound and total flavonoids in different parts(±s,, n == 33))

表4 不同部位的游離態黃酮、結合態黃酮和總黃酮的含量（±s，n==33）Table4 Contents of free, bound and total flavonoids in different parts(±s,, n == 33))

不同部位含量/（mg RE/100 g） 游離態黃酮占總黃酮比例/%游離態黃酮 結合態黃酮 總黃酮葉 1 995.47±217.73b 9.69±0.47d 2 005.16±218.20b 99.52根 2 488.21±295.56a 28.59±0.46a 2 516.80±296.02a 98.86花 1 662.56±177.87b 24.16±0.55c 1 686.72±178.42b 98.57莖 1 080.30±4.94c 26.51±0.6b 1 106.81±5.54c 97.61

2.4 大花羅布麻各部位清除DPPH自由基的能力

圖1 各部位對DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH free radical scavenging activities of different parts

由圖1可知，大花羅布麻葉的游離態多酚提取物清除DPPH自由基能力最強，達3 004.24 μmol Trolox/100 g，花與莖的總清除能力較低，在1 730.47～2 270.48 μmol Trolox/100 g范圍之間。不同部位游離態多酚對DPPH自由基清除能力存在顯著差異（P＜0.05）。游離態多酚的清除能力占總酚的86.79%～94.13%，結合態多酚占總酚的5.87%～13.21%。總之，各部位清除DPPH自由基的能力是以游離態多酚起主要作用，且與其相應含量呈正相關關系。

2.5 大花羅布麻各部位清除ABTS+?的能力

由圖2可知，大花羅布麻不同部位游離態多酚對ABTS+?清除能力存在顯著差異（P＜0.05），其中葉中游離態多酚提取物清除能力最強，高達1 876.01 μmol Trolox/100 g，葉的清除能力顯著高于其他部位。在結合態多酚提取物中，根的結合態多酚提取物清除能力最強，為308.18 μmol Trolox/100 g，是莖的4倍多。其中莖的總清除能力最低，為 1 688.25 μmol Trolox/100 g。此外，游離態多酚的清除能力占總多酚的86.57%～95.60%，結合態多酚占總酚的4.40%～13.43%。因此，各部位清除ABTS+?的能力都是以游離態多酚起主要作用。

圖2 各部位對ABBTTSS+?的清除能力Fig.2 ABTS free radical scavenging activities of different parts

2.6 大花羅布麻各部位的總還原能力

圖3 各部位的總還原力比較Fig.3 Comparison of total reducing power of different parts

由圖3可知，大花羅布麻各部位提取物的還原能力存在顯著性差異（P＜0.05），其中葉的游離態多酚還原能力最強，高達2 320.58 μmol VC/100 g，葉的總還原力顯著高于其他部位。在結合態多酚提取物中，葉的結合態多酚提取物清除能力最強，為476.16 μmol VC/100 g，是花的2倍多。花和莖的總還原能力相當。游離態多酚的還原能力占總多酚的82.17%以上。因此各部位的還原能力都是以游離態多酚起主要作用。

2.7 大花羅布麻各部位提取液中總多酚、總黃酮含量與抗氧化能力之間的相關性

將大花羅布麻各個部位提取物對DPPH自由基、ABTS+?清除能力和總還原力分別與相應部位總酚含量、總黃酮含量進行統計學回歸分析，得到各相關系數見表5。

表5 總多酚、總黃酮含量與抗氧化能力之間的相關性Table5 Linear corelations between antioxidant properties and total phenolics or flavonoid contents

由表5可知，大花羅布麻各部位提取物總多酚含量與抗氧化能力之間具有良好的線性關系，在0.05水平上，各提取液對DPPH自由基、ABTS+?清除能力和還原能力與總酚含量的相關系數分別為0.955 2、0.959 8與0.952 8，都大于0.950 0，為顯著性相關。但各提取物總黃酮含量與抗氧化能力之間的相關系數均小于0.950 0（P＜0.05），為相關性不顯著[18]。

3 討 論

游離態和結合態是植物體中酚類化合物的兩種主要存在形式，本實驗針對這兩種存在形式進行研究，以往研究主要集中對游離態酚類化合物的探討，因此其測定結果未包括結合態的部分。實驗樣品中酚類化合物的存在狀態研究表明：大花羅布麻不同部位中多酚和黃酮的存在形式主要以游離態存在（所占比例均大于90%），即在此大花羅布麻中，游離態多酚和游離態黃酮含量大致可表示其總多酚和總黃酮的含量。

大花羅布麻多酚含量的研究結果表明，植株不同部位之間多酚含量存在顯著差異。其葉中總多酚含量（（6286.68±129.16）mg GAE/100 g）比Liang Taigang等[19]報道的總多酚含量（（50.61±1.19）mg GAE/g）高；葉中總黃酮含量測定結果（（2 005.16±218.20）mg RE/100 g）與薛華茂等[20]研究的結果相一致，比Liang Taigang等[19]測定的總黃酮含量（（18.16±1.04）mg RE/g）高，但比石秋梅等[21]測定的總黃酮含量（3.54%）低些。不同部位總黃酮的含量順序：根（2.52%）＞葉（2.01%）＞花（1.69%）＞莖（1.11%）與石秋梅等[22]報道的大花羅布麻葉（3.54%）＞莖（0.56%）＞花（0.44%）＞根（0.33%）略有差異，主要原因可能是樣品采集時間、地點及栽培環境等因素不同所致。Adom等[22]研究發現小麥、大米、燕麥及玉米中多酚主要以結合態多酚形式存在，Sun Jie等[23]發現水果中多酚以游離多酚為主。本實驗中大花羅布麻游離態多酚占總酚的99%以上，表明該植物中多酚的存在形式與小麥、玉米等谷物不同，而與水果中的多酚存在形式相似，主要以游離態多酚形式存在。

抗氧化活性研究表明，供試樣品均具有較強的清除DPPH自由基、ABTS+?的能力和總還原能力。多酚提取物的總多酚含量與對DPPH自由基、ABTS+?清除能力和總還原能力之間有顯著的正相關關系（P＜0.05）。在清除DPPH自由基、ABTS+?和還原力模型中，游離態多酚的清除能力分別占總多酚的86.79%～94.13%、86.57%～95.60%和82.97%～91.02%。相關性分析也顯示其多酚含量與抗氧化能力呈良好的線性關系，說明在抗氧化體系中發揮清除能力的主要化合物可能是游離態多酚類物質。葉中多酚含量與抗氧化活性明顯高于其他部位，說明商品化的羅布麻茶的降血壓功效可能與其多酚與黃酮含量高密切相關[24]。因此，大花羅布麻葉可以作為一種保健食品和藥品的天然抗氧化劑資源進行深層次的開發與利用。

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