內蒙古奶豆腐中潛在益生性乳酸菌的篩選

王 輯，顧蕓佳，馬文慧，楊貞耐,*

（1.北京工商大學 食品質量與安全北京實驗室，北京 100048；2.吉林大學生物與農業工程學院，吉林 長春 130025）

益生菌是一類活性微生物，攝取一定量時，會對宿主產生確切健康功效從而改善宿主微生態平衡，發揮益生作用[1]。常見的益生菌主要包括乳桿菌（Lactobacillus）和雙歧桿菌（Bifidobacterium）[2]。據報道，益生菌具有調節腸道菌群結構、降低膽固醇、抗氧化、預防癌癥、抑制病原菌、緩解乳糖不耐癥、增強人體免疫力、緩解過敏和抑制腫瘤生長 等生理功能[3-5]。另外，益生菌的添加還可以改善發酵乳制品的質構，形成獨特的風味[6]。益生菌要想在人體內發揮功能特性，前提必須保證其在胃液的酸性環境、小腸中 的膽汁鹽環境以及厭氧環境中存活下來，同時還要對 腸道細胞具有一定的黏附性。因此，在益生菌的篩選過程中，菌株的胃液耐受性、膽鹽耐受性及細胞表面疏水性是必不可少的重要評定指標。

我國傳統發酵乳制品資源豐富，具有制作簡便、貯存時間較長、營養價值豐富及風味純正等特點。此外，傳統發酵乳制品中還具有豐富的乳酸菌資源。截止到目前，已有部分乳酸菌被分離出來，經研究發現這些菌株是安全可靠的，且具有潛在的益生性及功能特性。Li Shengyu等[7]從內蒙古奶豆腐中分離出一株產胞外多糖L.plantarum C88，研究發現該菌株具有良好的體 外抗氧化活性。張和平等[8]從新疆馬奶酒中分離得到1株L.casei Zhang，研究表明該菌株具有降膽固醇、免疫調節及抑制病原菌等生理功能。Wang Yanping[9]和Zhang Li[10]等分別從西藏靈菇中分離出1株L.plantarum MA2和L.plantarum K25，通過體內實驗發現2株菌均具有降低小鼠體內膽固醇的能力。崔文明等[11]從傳統乳制品中分離得到1株自溶活性較強的保加利亞乳桿 菌LJJ。Bao Yan等[12]對從傳統乳制品中分離出到的90株發酵乳桿菌的耐酸性、胃液耐受性、膽鹽耐受性及抑菌活性進行了研究，指出發酵乳桿菌F6的益生性最好，具有潛在的應用價值。

本研究主要通過對內蒙古奶豆腐源乳酸菌菌株的模擬人工胃液耐受性、膽鹽耐受性、疏水性、體外降膽固醇及抗氧化活性進行測定，著力于篩選出具有潛在益生特性的優良菌株，為今后開發新型功能性益生菌制品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

內蒙古各地區牧民自制的奶豆腐。

牛膽鹽、膽固醇、胃蛋白酶、1,1-二苯基-2-三硝基苯 肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；鄰苯二甲醛、氫氧化鉀 國藥集團化學試劑有限公司；正己烷、冰醋酸、濃硫酸 北京化工廠；亮綠 上海捷瑞生物工程有限公司；溶菌酶 中國醫科院友誼開發公司；蛋白酶K 美國Amresco公司；PCR反應所需相關試劑 北京鼎國生物有限公司；乳酸菌16S rDNA通用引物 中國農業大學提供。

1.2 儀器與設備

U-3900紫外-可見分光光度計 日本日立公司；BX53F正置熒光顯微鏡 日本奧林巴斯公司；T100TM Thermal Cycler PCR儀 美國Bio-Rad公司；MTN-2800W氮吹儀 北京華瑞博遠科技發展有限公司；JY92-ⅡDN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 培養基

MRS液體培養基（g/L）：大豆蛋白胨1 0.0、牛肉膏 10.0、酵母粉5.0、葡萄糖20.0、吐溫-80 1.0、磷酸氫二鉀2.0、乙酸鈉5.0、檸檬酸鈉5.0、硫酸鎂0.2、硫酸錳0.054，蒸餾水1 000 mL，1 mol/L乙酸調pH值為6.5，121℃滅菌15 min。

MRS-THIO液體培養基：向100 mL MRS培養基中加入0.2 g 巰基乙酸鈉，待充分溶解后，用1 mol/L乙酸調pH值為6.5，121℃滅菌15 min。

1.4 方法

1.4.1 菌株的分離純化

稱取1 g內蒙古奶豆腐樣品，加入99 mL pH 6.5無菌磷酸鹽緩沖液（phosphat buffered saline，PBS）中，充分振蕩混勻后，稀釋到10-4、10-5，取100 μL稀釋液涂布于MRS瓊脂平板上，置于37℃厭氧培養24～72 h，挑取典型單菌落，劃線分離純化。對分離所得的菌株進行革蘭氏染色和過氧化氫酶實驗。

1.4.2 菌株的16S rDNA分子鑒定

提取菌株的基因組DNA進行片段擴增：采用乳酸菌16S rDNA基因的通用引物，正向引物：A27F：5’-AGC GGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTAC GA-3’，反向引物：A1495R：3’-GCAGAGTTCTCGGA GTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-5’，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，目標片段長度約1 500 bp。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產物委托北京鼎國生物有限公司進行測序，將測序結果與國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Info rmation，NCBI）數據庫中的核酸序列進行比對。

1.4.3 菌株在模擬人工胃液中的耐受性測定

取活化好的菌液，4℃、6 000×g離心10 min，收集菌體。用無菌PBS緩沖液（pH6.5）洗滌2次，加入5 mL PBS緩沖液（pH 6.5）制成菌懸液。取1 mL菌懸液接入含9 mL pH 3.0的模擬人工胃液（0.2 g/100 mL NaCl，0.35 g/100 mL胃蛋白酶，過濾除菌）試管中，置于37℃厭氧培養。分別于接種后0 h和3 h取樣，稀釋涂布于MRS瓊脂平板上，37℃厭氧培養48 h后，進行活菌計數[13]。菌株存活率計算見公式（1）[14]。

式中：N1為胃液處理3 h后活菌數（lg（CFU/mL））；N0為胃液處理0 h活菌數（lg（CFU/mL））。

1.4.4 菌株對高質量濃度膽鹽的耐受性測定

將活化好的菌株按3%（V/V）接種量分別接種于含有0.3、0.5、1.0 g/100 mL膽鹽的MRS液體培養基中，37℃厭氧培養24 h，測定各培養基在560 nm波長處的吸光度（A560nm），以不添加膽鹽的培養基為對照，測定菌株的存活情況。

1.4.5 菌株的疏水性測定

取活化好的菌液，4℃、6 000×g離心10 min，收集菌體，用無菌的PBS緩沖液（pH6.5）洗滌2次。緩沖液作空白對照，用緩沖液調整菌體濃度，使其A560nm值為1.00。取3 mL調整后的菌液，分別加入0.6 mL的甲苯和十六烷，渦旋振蕩，靜置分層后，取下層水相，緩沖液作空白對照，在560 nm波長處測吸光度[15]。疏水率計算見公式（2）。

式中：A0為菌液與吸附劑混勻前的吸光度；A1為菌液與吸附劑混勻后的吸光度。

1.4.6 菌株的體外降膽固醇能力測定

將活化好的菌株按3%接種量分別接種于含0.01 g/100 mL膽固醇的MRS-THIO液體培養基中，37℃培養24 h，4℃、6 000×g離心10 min，收集上清。采用鄰苯二甲醛比色法測定上清液中膽固醇含量[13]，并計算菌株的膽固醇降解率，見公式（3）。

式中：A0為未接菌的高膽固醇培養基在550 mm波長處的吸光度；A1為發酵上清液在550 mm波長處的吸光度。

1.4.7 菌株的體外抗氧化活性測定

1.4.7.1 無細胞提取液的制備

將活化好的菌株按3%接種量接種于MRS液體培養基，37℃培養16 h，4℃、6 000×g離心10 min，收集菌體，無菌PBS緩沖液（pH 6.5）洗滌3次，重懸于PBS中，調整菌液濃度至108、109、1010CFU/mL。向各濃度菌液中添加溶菌酶至質量濃度0.1 g/100 mL，37℃恒溫水浴30 min，冰浴超聲破碎菌體細胞（超聲波功率800 W，超聲波每次輻射2 s，間隔2 s，總時間15 min）至顯微鏡下觀察無完整菌體，4℃、8 000×g離心10 min，收集上清液即為無細胞提取液，4℃保存備用。

主要采用BA樓控控制的方式，通過硬接點的形式接入DDC模塊實現，要了解風機盤管控制原理。風機盤管的電氣設計情況（見圖2）不同于通常的動力設備，風機盤管的功率較小，一般不單獨設置控制箱，電氣設計類似照明設計，單獨設置回路，且同時并接多個風機盤管設備，設置的數量與回路功率有關，只要保持功率在合理范圍內即可。

1.4.7.2 菌株對過氧化氫的耐受性測定

將活化好的菌株按1%接種量接種于含不同濃度（0、0.4、0.7、1.0 mmol/L）過氧化氫的MRS液體培養基中，37℃培養8 h，4℃、6 000×g離心10 min，收集菌體，無菌PBS緩沖液（pH6.5）洗滌3次，重懸于PBS中，于600 nm波長處測定其吸光度。

1.4.7.3 菌株清除羥自由基（?OH）能力的測定

采用Fenton法測定菌株對?OH的清除作用[15]。Fenton反應體系：0.435 mmol/L的亮綠1 mL，0.5 mmol/L的硫酸亞鐵2 mL，3 g/100 mL的過氧化氫1.5 mL。向Fenton反應體系中加入1 mL不同濃度菌株（108、109、1010CFU/mL）的無細胞提取液，混合均勻后，37℃恒溫水浴20 min，4℃、8 000×g離心10 min，取上清液，于624 nm波長處測吸光度。?OH清除率計算見公式（4）。

式中：A為無Fenton試劑、無樣品、有亮綠的吸光度；A0為有Fenton試劑、無樣品、有亮綠的吸光度；As為有Fenton試劑、有樣品、有亮綠的吸光度。

1.4.7.4 菌株清除DPPH自由基能 力的測定

取1 mL不同濃度的菌液（109、1010CFU/mL）加入2 mL DPPH甲醇溶液（0.5 mmol/L），混合均勻后室溫下避光反應30 min，4℃、8 000×g離心10 min，取上清液，于517 nm波長處測吸光度，無菌水空白調零。空白組以等體積甲醇代替DPPH溶液，對照組以等體積無菌水代替菌液[16]。DPPH自由基清除率計算見公式（5）。

式中：A為空白組的吸光度；A0為對照組的吸光度；As為樣品組的吸光度。

1.5 數據分析

2 結果與分析

2.1 菌株的分離純化

從內蒙古奶豆腐中共分離得到16株革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株。其中桿菌2株，球菌14株。

2.2 菌株16S rDNA分子鑒定

圖1 菌株的16S rDNA PCR擴增結果Fig.1 Electrophoregram of 16S rDNA amplification products of the strains

對提取菌株的總DNA進行PCR擴增，結果如圖1所示，擴增出16 條特異的、大小約為1 500 bp的條帶。獲得的特異性片段純化后進行測序，將測序結果用BL AST進行序列同源性比對，根據比對結果可鑒定菌株到屬。其中5株菌鑒定為屎腸球菌，分別是菌株M1-1、M6-2、M7-1、M8-1和M8-2；9株鑒定為乳酸片球菌，分別是菌株M1-3、M2-1、M2-2、M3-1、M4-1、M4-2、M5-1、M5-2和M5-3；1株鑒定為植物乳桿菌（M1-2）；1株鑒定為鼠李糖乳桿菌（M6-1），結果見表1。

表1 菌株鑒定結果Table1 Identification of screened strains

2.3 菌株在模擬人工胃液中的耐受性

圖2 菌株在模擬人工胃液中的耐受性Fig.2 The tolerance of the strains to simulated artificial gastric juice

由圖2可知，16株菌表現出不同程度的模擬人工胃液耐受性。L.plantarum M1-2、L.rhamnosus M6-1、E.faecium M1-1和M6-2耐受性較好，在pH 3.0模擬人工胃液中培養3 h后的存活率均超過了80%，其中E.faecium M6-2的耐受性最高，存活率達到了96.90%。有10株菌的耐受性一般，存活率在60%～80%之間。而P.acidilactici M3-1和M5-3的耐受性較差，存活率僅為36.09%和49.81%。

2.4 菌株對高質量濃度膽鹽的耐受性

小腸是人體吸收膽固醇的重要場所，同時也是乳酸菌發揮其降膽固醇作用的主要部位。正常人體小腸中膽汁鹽質量濃度在0.03～0.3 g/100 mL范圍內波動，乳酸菌若要定殖于小腸，就必須有一定的膽汁 鹽耐受的能力。從表2可以看出，隨著膽鹽質量濃度的升高，各菌株的生長受到不同程度的抑制，各菌株在相同膽鹽質量濃度下的生長情況存在顯著差異。其中E.faecium M7-1、M8-1和M8-2對膽鹽的耐受性較高，而其他菌株對膽鹽的耐受性較弱。

表2 不同膽鹽質量濃度下菌株的生長情況（以A56600 nnmm值表示）Table2 Tolerance of the strains to different concentrations of bile salts(represented by A560 nm)

2.5 菌株的疏水性

圖3 菌株的疏水性比較Fig.3 Comparison of the hydrophobicity of the strains

由圖3可知，在以甲苯和十六烷為吸附劑時，L.rhamnosus M6-1的疏水性最高，對甲苯和十六烷的疏水率分別為20.60%和22.15%，L.plantarum M1-2的疏水性較好，對甲苯和十六烷的疏水率分別為16.73%和15.58%，而其他菌株的疏水性較弱。

2.6 菌株的體外降膽固醇能力

圖4 菌株的體外降膽固醇能力比較Fig.4 Comparison of the in vitro cholesterol-reducing ability of the strains

由圖4可知，大部分菌株均有相應降低膽固醇的能力，但其能力大小因菌株的不同有所差異。其中E.faecium M1-1、L.plantarum M1-2、P.acidilactici M1-3和M2-1的體外降膽固醇能力較高，膽固醇降解率分別為54.44%、45.56%、34.44%和42.01%。而其他菌株的降解率除了P.acidilactici M2-2為26.89%以外，均在20%以下。

2.7 菌株的體外抗氧化活性

過氧化氫作為?OH的前體參與氧化過程，是衡量菌體抗氧化活性的一個重要指標。因此，本實驗通過分析菌株對過氧化氫的耐受情況，篩選具有抗氧化作用的益生菌株。受試16株菌在不同濃度過氧化氫中的生長狀況（以A600nm值表示）如表3所示，菌株對過氧化氫的耐受呈濃度依賴關系，多數菌株對低濃度過氧化氫（0.4 mmol/L）具有較強的耐受能力，37℃培養8 h后，A600nm大于1.0，而對高濃度過氧化氫（1 mmol/L）耐受能力較弱。其中L.plantarum M2-1、L.rhamnosus M6-1和E.faecium M8-2相比于其他菌株，對高濃度過氧化氫（1 mmol/L）的耐受性較強。

表3 不同過氧化氫濃度下菌株的生長情況（以A60000 nnmm值表示）Table3 Tolerance of the strains to different concentrations of hydrogen peroxide (represented by A60000 nnmm))

圖5 菌株對?OH的清除能力比較Fig.5 Comparison of the strains for scavenging activities on hydroxyl radicals

由圖5可知，不同菌株的?OH清除能力差異顯著，且菌株的清除能力呈濃度依賴關系，隨無細胞提取液濃度的增加，?OH的清除能力不斷提高。在受試的16株菌中，L.rhamnosus M6-1在1010CFU/mL時對?OH的清除能力最高，清除率為66.87%。此外，P.acidilactici M2-1、M4-2和 M5-3也表現出較高的?OH清除能力，在1010CFU/mL時對?OH的清除率均在50%以上。

圖6 菌株對DPPH自由基的清除能力比較Fig.6 Comparison of the strains for scave nging effects on DPPH free radicals

DPPH是一種穩定的有機自由基，當有自由基清除劑存在時，由于與其單電子配對顏色減退，從而檢測自由基清除情況及物 質的抗氧化能力。由圖6可知，16株菌對DPPH自由基的清除能力差異不明顯。其中L.rhamnosus M1-2對DPPH自由基的清除能力最高，清除率為55.58%，而其他菌株的清除率也均在40%以上。此外，菌株 對DPPH自由基的清除能力與菌液濃度呈依賴關系，隨菌液濃度的增加，DPPH自由基的清除能力不斷提高。

3 討 論

奶豆腐是我國蒙古族家庭經常食用的傳統發酵乳制品，它是用生奶自然發酵，至乳清與乳酪分離后煮沸而制成[17]。奶豆腐中含有大量的乳酸菌，從中篩選具有潛在益生特性的菌株已成為目前國內研究的熱點。本研究從內蒙古奶豆腐中分離得到16株疑似菌株，經革蘭氏染色、過氧化氫酶及16S rDNA鑒定，5株為屎腸球菌，9株為乳酸片球菌，植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌各1株。周雨霞[18]對內蒙古地區傳統發酵乳制品中乳酸菌進行了分離鑒定，認為植物乳桿菌是該地區乳制品中的優勢菌株。旭日花[19]也做了相似的研究，結果發現植物乳桿菌和乳酸乳球菌乳酸亞種是該地區乳制品中的優勢菌株。而本研究分離得到的16株菌中，乳酸片球菌占了56.3%，為優勢菌群。

益生菌在人體內發揮益生特性的前提條件是保證其在胃液的酸性環境、腸道的膽鹽環境和厭氧環境中存活下來。人體空腹時胃液pH值一般在1.3～1.8之間，進食后上升到3.0左右或更高，食物在胃中停留約3 h。正常人體小腸中膽汁鹽質量濃度在0.03～0.3 g/100 mL范圍內波動。本研究中，除了乳酸片球菌M3-1和M5-3以外，其余菌株均表現出較好的模擬人工胃液耐受性，在pH3.0的模擬人工胃液中培養3 h后，存活率均達到60%以上。在膽鹽耐受實驗中，屎腸球菌M7-1、M8-1和M8-2對膽鹽的耐受性較高，而其他菌株對膽鹽的耐受性較弱。

益生菌的篩選要求除了要具有耐受胃腸液的環境，還要對腸道上皮細胞具有一定的黏附性，保證其在微環境中成為優勢菌株，有利于益生特性的發揮。有研究[20]表明，菌株的黏附性與疏水性呈正相關，疏水性高有利于菌株定殖于腸道內。本研究中篩選得到2株疏水性較好的菌株，分別為鼠李糖乳桿菌M6-1和植物乳桿菌M1-2。Zago等[21]研究發現多數植物乳桿菌具有良好的細胞表明疏水性。Tuo Yanfeng等[22]研究發現鼠李糖乳桿菌對HT-29細胞具有較高的黏附性。

本研究通過在培養基中添加膽固醇（0.01 g/100 mL），采用鄰苯二甲醛比色法測定培養基中膽固醇質量濃度變化來評價菌株的體外降膽固醇能力。結果篩選出4株具有較高體外降膽固醇能力的菌株（屎腸球菌M1-1、植物乳桿菌M1-2、乳酸片球菌M1-3和M2-1），膽固醇降解率均超過了30%。目前，有關乳酸菌的降膽固醇機理大致可分為3種：1）乳酸菌的膽鹽水解酶活性使膽鹽由結合態轉變為脫結合態，與膽固醇發生共沉淀[23]；2）乳酸菌對膽固醇的直接吸附、吸收同化[24]；3）其他機理。關于乳酸菌的降膽固醇機理之所以尚無定論，主要是因為研究中所采用的膽鹽種類和添加量，膽固醇的種類和添加量，菌種自身的特性（耐酸、耐膽鹽、降膽固醇機制），喂養的飼料、實驗動物以及飼喂時間不同有關。

從表2菌株對膽鹽的耐受性結果可知，屎腸球菌M1-1、植物乳桿菌M1-2、乳酸片球菌M1-3和M2-1雖然具有較強的體外降膽固醇能力，但是這4株菌對膽鹽的耐受性均較弱。對于功能性較好而耐受性較弱的菌株，宜對菌株進行保護，如采用微膠囊化技術處理菌體，可以有效地保護菌體免受外界不良環境的影響，從而使其以活菌的形式到達人體腸道內，發揮其益生功能。Chávarri等[25]利用海藻酸和殼聚糖將格氏乳桿菌和雙歧桿菌進行微膠囊化，結果發現2株菌在模擬胃腸液中均表現出良好的存活能力。Brinques等[26]研究發現利用微膠囊技術可提高乳桿菌在酸奶冷藏期間的存活能力。許女等[27]研究發現微膠囊化的植物乳桿菌MA2的耐熱性和恒溫儲存性能都顯著高于未微膠囊化的菌體。

抗氧化活性是益生菌非常重要的生理功能指標。研究表明，益生菌主要是通過耐受一定濃度O2或H2O2、清除機 體內有害自由基（DPPH自由基、?OH和超氧陰離子自由基）、抗脂質過氧化及產生抗氧化物質（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化氫酶及過氧化氫酶）等作用發揮其抗氧化活性[28]。本研究主要通過對菌株的過氧化氫耐受性、?OH和DPPH自由基的清除能力，來評價其體外抗氧化活性。結果篩選出1株具有較強體外抗氧化活性的菌株，為鼠李糖乳桿菌M6-1。此外，本研究還發現菌株的體外抗氧化活性與菌液濃度呈依賴關系，隨菌液濃度的增加，?OH和DPPH自由基的清除能力不斷提高。

4 結 論

本研究從內蒙古奶豆腐中分離得到16株菌，其中9株鑒定為乳酸片球菌、5株為屎腸球菌、1株為植物乳桿菌、1株為鼠李糖乳桿菌。對這些菌株進行模擬人工胃液和膽鹽耐受性、疏水性、體外降膽固醇及抗氧化活性測定的結果表明：菌株對模擬人工胃液和膽鹽具有不同程度的耐受性，對甲苯和十六烷具有不同的疏水性；腸球菌M1-1、植物乳桿菌M1-2、乳酸片球菌M1-3和M2-1的體外膽固醇降解率均超過30%；鼠李糖乳桿菌M6-1對過氧化氫的耐受性、?OH和DPPH自由基的清除能力最高。綜上所述，植物乳桿菌M1-2和鼠李糖乳桿菌M6-1具有較好的益生特性，可作為今后開發功能性產品的潛在益生菌資源。

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