紅曲霉產琥珀酸與酯化酶的變化規律

蔡穎慧，潘佩平，黃 瀟，蘇檳楠，王慕華

（1.山西省生物研究所，山西 太原 030006；2.山西省分析科學研究院，山西 太原 030006）

紅曲霉（Monascus purpureus Went），散囊菌目中的一屬子囊菌曲霉科真菌，可產生紅曲色素、糖化酶、酯化酶和蛋白酶等各種酶類，廣泛應用于食品著色、釀酒、食品發酵[1-2]。1979年日本學者發現紅曲霉可產生Monacolin K，具有降膽固醇、降血壓的功能[3]。此外，紅曲霉還能產生抑菌物質、抗氧化、麥角固醇等多種活性物質[4-5]。近年來，不少研究致力于利用紅曲霉代謝產物來治療非酒精性脂肪性肝病及骨質疏松等多種疾病[6]。

琥珀酸（succinic acid），學名為丁二酸，是一種理想的風味增強劑，它的存在，可以減少酸味刺激感，入口而覺綿軟。琥珀酸是合成許多高附加值產品的重要前體物質，在食品及化工行業廣泛應用[7]，由于化學法制備琥珀酸會對環境造成污染，近年來利用微生物發酵生產琥珀酸受到廣泛關注[8-9]。

實驗室從老陳醋用大曲中分離到1株紅曲霉菌株Monascus purpureus M1，該菌株產酯化酶能力強。紅曲霉酯化酶具有強的催化已酸乙酯的能力，酯化酶酶促反應產物在釀酒中起著重要的增香作用[10]。但目前關于對紅曲霉產琥珀酸的動態變化規律研究尚少。

本實驗將紅曲霉傳統功能與新的研究方面相結合，對Monascus purpureus M1產琥珀酸及酯化酶動態變化情況進行跟蹤測定，尋找紅曲霉發酵積累琥珀酸與酯化酶的最佳條件，為進一步研究實現琥珀酸和酯化酶的聯產提供理論基礎和數據支持，為紅曲霉在食品發酵進一步開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑與培養基

菌株：紅曲霉M1（Monascus purpureus M1），實驗室分離自老陳醋用大曲。

琥珀酸（色譜純） 美國Supelco公司；其余試劑均為分析純。

斜面培養基（g/L）：葡萄糖40、蛋白胨15、MgSO4?7H2O 1、K2HPO4?3H2O 1.5、瓊脂20，pH值自然。

種子培養基（g/L）：葡萄糖50、蛋白胨15、MgSO4?7H2O 1、K2HPO4?3H2O 1.5，pH值自然。

發酵培養基（g/L）：葡萄糖50、可溶性淀粉60、蛋白胨15、MgSO4?7H2O 1、K2HPO4?3H2O 1.5，pH值自然。以上培養基0.1 MPa、121℃濕熱滅菌20 min[11]。

1.2 儀器與設備

UV-2450 型紫外分光光度計 日本島津公司；ZKSY-600智能恒溫水浴鍋 南京科爾儀器設備有限公司；1100系列高效液相色譜儀 美國惠普公司；JS-HS冷凍離心機 美國Beckman公司；PHS-3C型精密pH計上海雷磁儀器廠。

1.3 培養方法

種子培養：以5 mL無菌水洗下斜面培養的菌體，制成1×106個/mL的孢子懸浮液，取懸浮液5 mL接至裝液量為50 mL/250 mL三角瓶的種子培養基中，30℃搖床振蕩（180 r/min）培養2 d。

搖瓶培養：按10%接種量將培養好的種子液體，接至裝液量為50 mL/250 mL三角瓶的發酵培養基中，30℃搖床振蕩（180 r/min）培養10 d。

1.4 菌體干質量測定

每天取適量發酵液，經恒重濾紙過濾，將濾紙連菌體在105℃烘至恒質量，稱量，即可求得菌體干質量[11]。

1.5 琥珀酸測定

將紅曲霉發酵液與菌絲體分離，取5 mL紅曲霉生長各階段發酵液，超濾離心（PES膜，10 kD）[12]除去菌體后，取1 mL 上清液進行適當稀釋即得到待測液。色譜條件：色譜分離柱：Eclipse XDB-C8（4.6 mm×150 mm，5 μm）；保護柱：HP hypersil ODS C18（2.1 mm×20 mm，5 μm）；流動相：0.005 mol/L pH 2.5硫酸水溶液；流動相流速：1 mL/min；檢測器：可變波長檢測器；進樣量：10 μL；柱溫：室溫[13]。

1.6 酯化酶活力測定

將紅曲霉發酵液與菌絲體進行分離，取5 mL 紅曲霉生長各階段發酵液，離心（10 000 r/min、10 min）除去菌體，取1 mL上清液進行適當稀釋即得到待測液。

取稀釋后的酶液0.5 mL，加入pH 6.0的磷酸緩沖液3.0 mL和2.5 mmol/L醋酸-α-萘酯0.1 mL，37℃保溫15 min，加入固蘭B鹽0.4 mL，37℃保溫10 min，以不加醋酸-α-萘酯空白管調零，立即在528 nm波長處測定光密度。酶活力定義：37℃、15 min水解醋酸-α-萘酯產生1 nmol α-萘酚所需的酶量，單位為U/mL[14]。

1.7 紅曲霉培養條件優化

1.7.1 接種量的影響

接種量設置為8%、10%、12%（接種量均為體積分數，下同）。溫度30℃、轉速180 r/min培養9 d。

1.7.2 pH值的影響

發酵培養基初始pH值設置為2.5～7.5，溫度30℃、轉速180 r/min，培養6 d。

1.7.3 正交試驗

根據單因素試驗結果及發酵過程中的實際情況，進行適當調整，擬定不同因素水平。考察接種量、pH值、發酵溫度、轉速對產琥珀酸量及酯化酶活力的影響，尋找紅曲霉發酵過程最佳組合，采用L9（34）正交試驗。

1.7.4 菌形實驗

將前培養過程中得到的不同形態（團狀、絲狀、顆粒狀）的菌體以10%的接種量轉接到初始pH 6.5的紅曲霉發酵培養基，30℃、180 r/min培養6 d。

2 結果與分析

2.1 紅曲霉生長曲線及琥珀酸含量變化規律

圖1 紅曲霉生長曲線及琥珀酸含量變化Fig.1 Growth curve of Monascus purpureus and changes in succinic acid production

由圖1可知，紅曲霉在3～6 d紅曲霉的生長比較快，在第6天菌體干質量達到最大值3.24 g，之后菌體量就略微下降，說明紅曲霉從第6天開始進入衰亡期。在紅曲霉生長第2天即有琥珀酸的出現，隨著時間的延長，琥珀酸含量逐漸增加，在紅曲霉生長的第5天左右即達到最大值3.62 g/L，之后琥珀酸含量明顯下降。

琥珀酸是三羧酸循環的中間體，霉菌中普遍存在丙酮酸羧化支路，代謝過程中琥珀酸脫氫酶活性減弱，琥珀酸積累，并且琥珀酸屬于小分子物質，可以透過細胞膜釋放到細胞膜外[15]。在本實驗中琥珀酸質量濃度先增后減，由此推測，琥珀酸的產生主要是作為紅曲霉三羧酸循環代謝途徑的中間產物[16]，它在不斷生成也在不斷消耗。

2.2 紅曲霉產琥珀酸及酯化酶變化規律

圖2 紅曲霉生長過程中琥珀酸含量及酯化酶活性的變化Fig.2 Changes in succinic acid and esterifying enzyme production during the growth of Monascus purpureus

由圖2可知，紅曲霉積累酯化酶與琥珀酸的最高峰并不在同一時期，琥珀酸在紅曲霉生長的第5天達到最大值，而酯化酶在紅曲霉的生長過程中不斷的積累。酯化酶在酶學上是解酯酶的統稱，包括脂肪酶和酯酶，同糖化酶一樣，也是紅曲霉產生的一種一級代謝產物[17]，酯化反應中兩種酶的比例對酯的生成產生影響。紅曲霉酯化酶的代謝極為復雜，目前對其作用機理及代謝產物形成特點的報道甚少。

發酵第5天琥珀酸質量濃度最高，為3.57 g/L，此時酯化酶活力為99.14 U/mL，隨后琥珀酸質量濃度下降，而酯化酶不斷積累，總酶活力緩慢增加。發酵第6天，琥珀酸質量濃度2.94 g/L ，而酯化酶活力為128.5 U/mL，發酵至第9天，可達143.65 U/mL。隨后琥珀質量濃度下降較為明顯，而酯化酶活力增加緩慢。因而，為兼顧琥珀酸及酯化酶的產量，初步認為，發酵至第6天為最佳積累期。

2.2.1 不同接種量時紅曲霉產琥珀酸及酯化酶變化規律

圖3 不同接種量下紅曲霉產琥珀酸變化規律Fig.3 Dynamics of succinic acid production with different inoculum size by Monascus purpureus

如圖3所示，接種量為12%時，紅曲霉產琥珀酸在第5天達到最高值3.68 g/L，但隨后迅速下降，當接種量為10%和8%時，紅曲霉產琥珀酸最高峰均有所延遲，第6天達到最高峰，下降速度也較為緩慢，琥珀酸最高質量濃度分別為3.59 g/L和2.95 g/L。

圖4 不同接種量下紅曲霉產酯化酶變化規律Fig.4 Dynamic changes in esterifying enzyme activities from Monascus purpureus with different inoculum sizes

如圖4所示，紅曲霉生長前期產酯化酶隨著接種量的增加而有所提高，隨著時間的增加，酯化酶積累速率有所下降，最終至紅曲霉生長第9天，總的積累量極為接近。接種量為12%、10%、8%時，發酵至第5天，酯化酶總活力分別為129.78、116.14、89.20 U/mL；發酵至第6天，酯化酶總活力分別為143.22、140.65、119.91 U/mL。

接種量小，菌體生長緩慢，發酵周期延長，菌體活力低，誘導次級代謝產物產生的酶少，琥珀酸及酯化酶產量小。接種量大，菌體生長旺，較快達到穩定期，琥珀酸被菌體自身利用的速度加快，而且培養液黏度增加，影響后期產物積累。總的來看，琥珀酸質量濃度在第5～6天變化不大，而酯化酶變化較大。綜合考慮，接種量10%、發酵第6天結束，可兼顧琥珀酸及酯化酶的積累。

2.2.2 pH值對紅曲霉產琥珀酸及酯化酶的影響

圖5 不同pH值條件下紅曲霉產琥珀酸含量及酯化酶活性變化Fig.5 Changes in succinic acid and esterifying enzyme production by Monascus purpureus at different initial pH values

發酵至第6天，測定培養基初始pH 2.5～7.5范圍內紅曲霉產琥珀酸含量及酯化酶活力，結果如圖5所示。pH 2.5時，紅曲霉產琥珀酸及酯化酶活力都比較低，隨著pH值的升高，琥珀酸含量及酯化酶活力均提高。pH 6.5時，琥珀酸含量及酯化酶活力最高，分別為3.72 g/L和 143.62 U/mL。

很可能低pH值能夠抑制三羧酸循環中一些關鍵酶（順烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶）的活性，從而抑制了三羧酸循環，導致中間代謝產物琥珀酸的積累降低[18]，同時也影響紅曲霉生長代謝，最終導致酯化酶產量降低，并且低pH值還會破壞酯化酶的活性。另外，低pH值也可能影響紅曲霉細胞膜所帶電荷的狀態，改變細胞膜的通透性，進而影響微生物對營養物質的吸收和代謝產物的排泄。實驗還發現，低pH值還可以改變紅曲霉在液體培養中的菌體形態，促進緊密菌團的形成。

2.2.3 正交試驗結果

表1 正交試驗設計與結果Table1 Orthogonal array design with experimental results

表1結果表明，在幾個影響因子中，極差結果為A＞B＞C＞D，說明初始pH值為影響紅曲霉產琥珀酸及酯化酶的最主要因素，其次為接種量、溫度和轉速。正交試驗得出的最優組合為A2B2C3D2，即接種量10%、初始pH 6.5、溫度30℃、轉速180 r/min。

2.2.4 菌體形態對紅曲霉產琥珀酸及酯化酶的影響

表2 不同形態菌體產琥珀酸及酯化酶的差異Table2 Comparison of the abilities of different forms of Monascus purpureus to produce succinic acid and esterifying enzymes

相比于團狀、絲狀菌體，顆粒狀菌體發酵液表觀黏度較低，由表2可知，菌體呈顆粒狀的紅曲霉產琥珀酸及酯化酶的能力明顯高于絲狀及團狀紅曲霉，顆粒狀菌體發酵狀態下，琥珀酸積累量達到3.79 g/L，酯化酶活力可達到152.36 U/mL。而團狀紅曲霉30℃培養6 d后，琥珀酸的積累量僅為3.28 g/L，酯化酶活力僅達到117.72 U/mL。很多研究結果證明，在液體發酵過程中，絲狀真菌的形態對產物的生產有很大的影響，菌體形態可以直接或間接地影響發酵過程，如改變傳質、傳氧或導致其他一些目前仍不清楚的原因，最終改變整個發酵的效果[19-21]。

3 結 論

本實驗研究了紅曲霉Monascus purpureus M1發酵產琥珀和酯化酶的變化規律，并對不同時間、接種量、pH值及菌體狀態對紅曲霉聯產琥珀酸和酯化酶影響進行了分析。紅曲霉生長至第6天菌體干質量達到最大，而琥珀酸在紅曲霉生長的第5天即達到最高質量濃度，隨后琥珀酸含量呈下降明顯。因而，琥珀酸主要作為紅曲霉三羧酸循環的中間代謝產物存在。酯化酶是紅曲霉產生的一級代謝產物，在紅曲霉生長過程中不斷地積累。顆粒狀菌體便于琥珀酸及酯化酶的積累。正交試驗進一步表明，接種量為10%、初始pH 6.5、30℃、180 r/min發酵至第6天，可兼顧琥珀酸及酯化酶的積累。下一步將對Monascus purpureus M1聯產琥珀酸和酯化酶進一步進行發酵工藝優化，增加琥珀酸和酯化酶的生成，為綜合利用Monascus purpureus M1提供參考。

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