鯽魚卵唾液酸糖蛋白對去卵巢大鼠骨質疏松癥的改善作用

王姍姍，周曉春，李秀秀，薛長湖，王靜鳳*

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

骨質疏松癥是一種以骨量減少、骨密度降低、骨組織微結構改變而導致骨脆性和骨折危險性增高為特征的全身性骨骼疾病，其產生原因與骨重建過程中成骨細胞介導的骨生成和破骨細胞介導的骨吸收之間的平衡失調有關[1]。骨質疏松癥已成為一個世界范圍內越發嚴重的社會健康問題，據估計目前全世界患者人數已超過2 億，其發病率已躍居常見病、多發病的第7位。骨質疏松癥患者預計到2050年將增加到2.2 億，其中 一半以上將發生在亞洲，絕大多數將在我國[2]。目前，市場上用于預防和治療骨質疏松癥的藥物主要包括雌激素受體調節劑、雙磷酸鹽類、降鈣素、氟制劑和VD及其活性代謝物類藥物等[3]，但長期服用具有較強的毒副作用，因此尋找安全有效的防治骨質疏松癥的生物活性物質已成為目前的研究熱點。

魚卵是水產加工的主要廢棄物之一[4]。它含有豐富的蛋白質、脂肪、礦物質和多種維生素等，具有很高的營養價值[5]，但對魚卵的高值化加工利用主要集中在功能脂質方面[6]。有關魚卵糖蛋白的研究主要集中在胚胎發育[7]、分離純化[8]、生化特性[9]、模式識別和作為污染標志物等發育生物學和生態毒理學方面，但在食品加工方面的研究和應用目前尚無發現。前期采用MC3T3-E1成骨細胞對不同水產動物卵進行活性篩選，研究結果表明，其唾液酸含量與增殖活性成正相關，其中鯽魚卵的作用效果最好。上述調查研究可知鯽魚卵具有潛在的利用價值和較大的開發空間。

本研究通過摘除雙側卵巢的方法建立骨質疏松癥大鼠模型，從鯽魚卵中提取唾液酸糖蛋白研究其對骨質疏松癥的改善作用并探討其作用機制，旨在為鯽魚卵的高值化利用和抗骨質疏松癥的藥物開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與動物

鮮活雌性鯽魚購于青島大連路水產品市場。

健康SD大鼠，雌性，體質量（200±20）g，SPF級，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.1.2 試劑

阿侖膦酸鈉片 石家莊石藥集團歐意藥業有限公司；鈣測定試劑盒 北京中生北控生物科技股份有限公司；磷、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase，TRACP）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；雌二醇（estradiol，E2）、脫氧吡啶啉（deoxypyridinoline，DPD）、組織蛋白酶K（cathepsin-K，Cath-K）、骨源性堿性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BALP）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、Ⅰ型前膠原羧基端前肽（propeptide carboxy-terminal procollagen，PICP）、骨保護素（osteoprotegerin，OPG）、核因子κB受體活化因子（receptor activator for nuclear factor-κB，RANK）、核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）酶聯免疫吸附測定試劑盒美國R&D公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

LABOROTA 4000型旋轉蒸發儀 德國Heidolph公司；ALPHA 1-4 LO型凍干機 德國Christ公司；GL-20M型高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器公司；680型酶標儀 美國Bio-Rad公司；Agilent 1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 鯽魚卵唾液酸糖蛋白的制備和化學成分分析

活體雌性鯽魚處死后取出新鮮成熟魚卵，在低溫條件下除雜、勻漿、冷凍干燥。干物加入95%乙醇脫脂，冷風干燥得脫脂鯽魚卵。將脫脂鯽魚卵干物按1∶30（m/V）的料液比加水，于4℃攪拌水提過夜，離心，45℃旋轉蒸發濃縮，冷凍干燥，得鯽魚卵唾液酸糖蛋白。采用二極管陣列串聯高效液相色譜法檢測鯽魚卵唾液酸糖蛋白中唾液酸含量為5.89%，苯酚-硫酸法檢測多糖含量為7.94%，福林-酚法檢測蛋白質含量為44.25%，鉬藍比色法檢測磷含量為1.78%。

1.3.2 骨質疏松癥模型的建立及動物分組

采用雙側卵巢摘除法建立骨質疏松癥模型。將雌性SD未交配大鼠適應性喂養7 d后，隨機分為去卵巢組和假手術組，腹腔注射3.3 mL/kg的10%水合氯醛麻醉大鼠，去卵巢組摘除大鼠雙側卵巢，假手術組切除大鼠腹腔內一小塊脂肪，術后連續3 d注射慶大霉素抗感染治療，術后90 d大鼠尾靜脈取血，檢測E2含量、TRACP和ALP活性，以去卵巢組與假手術組相比大鼠血清E2水平顯著降低（P＜0.01），TRACP和ALP活性顯著升高（P＜0.01）判定大鼠成模。

將成模大鼠隨機分為假手術組、模型對照組、陽性對照組、鯽魚卵唾液酸糖蛋白組，每組10只。鯽魚卵唾液酸糖蛋白組灌胃400 mg/（kg·d）鯽魚卵唾液酸糖蛋白，陽性對照組灌胃1 mg/（kg·d）的阿侖膦酸鈉，模型對照組和假手術組灌胃生理鹽水。灌胃體積1 mL/100 g，每天1次，連續灌胃90 d。實驗期間大鼠自由飲水，進食標準飼料，每3 d稱量一次大鼠體質量。實驗結束前5 d將大鼠放入代謝籠，收集24 h尿液，離心取上清，備用。于末次給藥后，大鼠禁食不禁水12 h，經乙醚麻醉后腹主動脈采血，分離血清，備用。

1.3.3 尿液脫氧吡啶啉、鈣、磷含量的測定

具體操作方法參照相應試劑盒說明書。

1.3.4 血清Cath-K、TRACP活性的測定

具體操作方法參照相應酶聯免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒說明書。

1.3.5 血清骨源性ALP活性和OCN、PICP含量的測定

具體操作方法參照相應ELISA試劑盒說明書。

1.3.6 血清OPG、RANK、RANKL含量的測定

具體操作方法參照相應ELISA試劑盒說明書。

1.4 統計學分析

數據分析采用SPSS11.0軟件進行單因素方差分析，并采用LSD法進行兩兩比較，P＜0.05為差異顯著，實驗數據用±s表示。

2 結果與分析

2.1 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對骨質疏松癥大鼠尿液DPD、Ca、P含量的影響

表1 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對骨質疏松癥大鼠骨吸收指標的影響（±s，n==1100）Table1 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on the indexes of bone absorption (± s,, n = 1100))

表1 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對骨質疏松癥大鼠骨吸收指標的影響（±s，n==1100）Table1 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on the indexes of bone absorption (± s,, n = 1100))

注：# #.與假手術組相比，差異極顯著（P＜0.01）；*.與模型對照組相比，差異顯著（P＜0.05）；**.與模型對照組相比，差異極顯著（P＜0.01）。下同。

組別 DPD含量/（nmol/L） Ca含量/（mmol/L） P含量/（mmol/L） TRACP活力/（U/L） Cath-K含量/（pg/mL）假手術組 43.43±8.55 0.4 3±0.03 31.17±5.82 19.98±2.58 1 273.54±104.85模型對照組 82.20±8.09## 1.29±0.24## 53.51±2.74## 42.18±1.67## 2 450.90±153.01##陽性對照組 64.02±6.15** 0.93±0.23** 41.29±2.06** 30.80±1.26** 1 558.6±114.02**唾液酸糖蛋白組 60.69±5.92** 0.69±0.09** 33.32±1.62** 22.97±2.84** 1 489.32±118.80**

由表1可知，DPD是Ⅰ型膠原的分解產物，是反映骨吸收的特異性指標。模型對照組大鼠尿液DPD含量較假手術組顯著升高；灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后，DPD含量顯著降低，與模型對照組相比降低了26.16%（P＜0.01）。去卵巢大鼠骨吸收增加，溶骨活性增強，骨中Ca、P釋放進入血液循環，經腎臟后以尿液形式排出，因此尿液中Ca、P含量一定程度上反映骨鹽丟失情況。模型對照組大鼠尿液Ca、P含量較假手術組顯著升高；與模型對照組相比，灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后Ca、P含量顯著降低，分別降低了46.87%（P＜0.01）和37.73%（P＜0.01），且鯽魚卵唾液酸糖蛋白的作用效果較陽性對照組藥物作用效果更顯著。結果表明鯽魚卵唾液酸糖蛋白可有效抑制骨質疏松癥大鼠骨吸收，防止骨礦鹽丟失。

2.2 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對骨質疏松癥大鼠血清TRACP、Cath-K活性的影響

由表1可知，TRACP由破骨細胞合成并分泌，它參與骨基質中固體鈣磷礦化底物的降解；Cath-K是由破骨細胞分泌的一種能水解Ⅰ型膠原的蛋白酶，二者都是敏感的特異性骨吸收標志物。模型對照組大鼠血清TRACP、Cath-K活性較假手術組顯著升高。灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后二者活性均顯著降低，與模型對照組相比，分別降低了45.55%（P＜0.01）和39.23%（P＜0.01），且鯽魚卵唾液酸糖蛋白作用效果優于陽性對照組的藥物作用效果。結果表明鯽魚卵唾液酸糖蛋白可顯著抑制骨質疏松癥大鼠骨吸收。

2.3 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對骨質疏松癥大鼠血清BALP活性和OCN、PICP含量的影響

表2 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對骨質疏松癥大鼠骨生成指標的影響（±s，n==1100）Table2 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on serum indexes associated with bone formation (± s,, n = 1100))

表2 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對骨質疏松癥大鼠骨生成指標的影響（±s，n==1100）Table2 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on serum indexes associated with bone formation (± s,, n = 1100))

組別 BALP活力/（U/L） OCN含量/（ng/mL） PICP含量/（ng/mL）假手術組 85.08±3.45 3.46±0.45 6.25±0.36模型對照組 190.01±6.65## 6.25±0.46## 8.61±0.53##陽性對照組 113.53±4.24** 3.85±0.32** 6.40±0.37**唾液酸糖蛋白組 103.97±4.93** 3.70±0.58** 6.45±0.25**

由表2可知，BALP是成骨細胞分泌的胞外酶，參與骨的礦化過程，可反映成骨細胞活性。與假手術組相比，模型對照組大鼠血清BALP活性升高了123.35%（P＜0.01）；灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后，BALP活性顯著降低，與模型對照組相比降低了45.28%（P＜0.01）。OCN是由成骨細胞合成并分泌的骨組織中最豐富的非膠原蛋白。模型對照組與假手術組大鼠相比血清OCN含量升高了80.94% （P＜0.01）；灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后OCN含量降低了40.85%（P＜0.01）。

PICP與骨基質的重要組成成分Ⅰ型膠原的合成成正相關。與假手術組相比，模型對照組PICP含量顯著升高；灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后，PICP含量顯著降低，與模型對照組相比降低了25.17%（P＜0.01）。結果表明鯽魚卵唾液酸糖蛋白能有效抑制骨質疏松癥大鼠高骨轉換速率，防止骨丟失。

2.4 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對骨質疏松癥大鼠血清OPG、RANK、RANKL含量的影響

表3 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對骨質疏松癥大鼠血清OPG、RANNKK和RANKL含量的影響（±s，n==1100）Table3 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on the contents of OPG, RANK and RANKL in serum (± s,, n = 1100))

表3 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對骨質疏松癥大鼠血清OPG、RANNKK和RANKL含量的影響（±s，n==1100）Table3 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on the contents of OPG, RANK and RANKL in serum (± s,, n = 1100))

組別 OPG含量/（pg/mL） RANK含量/（pg/mL） RANKL含量/（pg/mL） RANKL/OPG假手術組 12.47±1.45 34.44±3.09 15.75±1.01 1.27±0.14模型對照組 7.01±1.08## 36.27±5.82# 29.42±3.07## 4.29±0.86##陽性對照組 9.23±1.18** 30.77±4.16* 21.72±1.81** 2.37±0.28**唾液酸糖蛋白組 10.97±0.62** 28.70±2.65* 19.80±1.86** 1.77±0.11**

由表3可知，OPG和RANKL由成骨細胞分泌，RANK由破骨細胞前體細胞分泌，OPG通過競爭性地與RANKL結合，可阻斷RANKL與RANK的相互作用，抑制破骨細胞增殖分化，因此RANKL和OPG的比值決定了骨吸收的程度。模型對照組血清OPG含量顯著低于假手術組，RANK、RANKL含量顯著高于假手術組，且模型對照組RANKL/OPG比值與假手術組相比升高了236.37%（P＜0.01）。灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后，與模型對照組相比，OPG含量降低了56.50%（P＜0.01），RANK含量降低了20.87%（P＜0.05），RANKL含量降低了32.69%（P＜0.01），RANKL/OPG比值降低了58.74%（P＜0.01），且鯽魚卵唾液酸糖蛋白作用效果優于陽性對照藥物的作用效果。結果證明鯽魚卵唾液酸糖蛋白能通過下調RANKL/OPG比值來抑制破骨細胞形成，從而抑制骨吸收。

3 討 論

切除卵巢是復制骨質疏松癥模型的經典方法，與臨床上絕經后骨質疏松癥極為相似。絕經后骨質疏松癥的動物模型是由Saville[10]于1969年首先用大鼠建立的，由于大鼠去卵巢后的骨丟失與婦女絕經后的骨丟失有許多相似之處，故去卵巢大鼠骨質疏松癥模型已成為標準化的、公認的研究絕經后婦女骨質疏松癥的經典病理模型[11]，目前已在國內外廣泛的應用[12-13]。本實驗通過切除大鼠雙側卵巢建立骨質疏松癥模型，以鯽魚卵唾液酸糖蛋白為受試物研究其對骨質疏松癥的改善作用，測定骨吸收、骨生成指標和OPG、RANK、RANKL含量，并對其作用機制進行初步探索。結果顯示，鯽魚卵唾液酸糖蛋白可顯著降低骨質疏松癥大鼠骨吸收和骨生成指標，改善大鼠高骨轉換狀態，顯著下調血清RANKL含量，上調OPG含量，降低RANKL/OPG比值。

骨代謝主要以骨重建形式進行，在調節激素和局部細胞因子等協同作用下，不斷吸收舊骨，生長新骨，周而復始，循環進行，形成了體內骨骼相對穩定狀態。破骨細胞介導的骨吸收相對增強，或者成骨細胞介導的骨生成相對減弱，使骨凈吸收增加，骨微結構紊亂，最終導致骨質疏松癥發生[14]。在骨吸收發生時，骨的Ⅰ型膠原會分解生成DPD，釋放到血液中并以原形直接經腎臟以尿液形式排出[15]。Ca、P主要作用是促進骨基質的合成和骨礦沉積，當骨丟失嚴重時，尿液中Ca、P含量升高。TRACP由破骨細胞合成并直接分泌進入血液循環，半衰期長，穩定性好，可反映破骨細胞活性和骨吸收狀況[16]。Cath-K是破骨細胞分泌的一種半胱氨酸蛋白酶，能水解Ⅰ型膠原等骨基質蛋白，是重要的破骨細胞分子標記物和骨吸收標志性指標[17]。實驗結果顯示鯽魚卵唾液酸糖蛋白可顯著降低去卵巢大鼠尿液DPD、Ca、P含量，顯著抑制血清Cath-K、TRACP活性。表明鯽魚卵唾液酸糖蛋白具有抑制骨質疏松癥大鼠骨吸收，防止骨礦鹽丟失的作用。

當骨中鈣鹽沉積不足時，成骨細胞對BALP的分泌增多，BALP是評價骨礦化障礙的最佳指標[18]。OCN可用于直接反映骨生成的速率[19]，它是骨組織中最豐富的非膠原蛋白，骨更新速率越快，成骨細胞分泌OCN越多。Ⅰ型膠原是骨基質的重要組成成分，PICP與Ⅰ型膠原的合成呈正相關[20]。實驗結果顯示，鯽魚卵唾液酸糖蛋白可顯著降低去卵巢大鼠血清BALP活性和OCN、PICP含量。表明鯽魚卵唾液酸糖蛋白具有抑制骨質疏松癥大鼠高骨轉換速率，防止骨丟失的作用。

OPG/RANKL/RANK系統是成骨細胞作用于破骨細胞的重要途徑，是目前骨質疏松癥防治的一個重大突破[21]。OPG和RANKL主要由成骨細胞分泌，其中，RANKL通過與破骨細胞表面靶信號受體RANK作用，促進破骨細胞增殖、分化、成熟和活化，引起骨吸收。而OPG可競爭性地與RANKL結合，從而阻斷骨吸收信號的傳遞。因此，RANKL/OPG的比例是骨吸收的關鍵因素之一[22]。實驗結果顯示，鯽魚卵唾液酸糖蛋白可顯著上調去卵巢大鼠血清OPG含量，下調RANKL含量，降低RANKL/OPG比值。表明鯽魚卵唾液酸糖蛋白具有抑制破骨細胞增殖分化，防止骨吸收的功能。

綜上所述，鯽魚卵唾液酸糖蛋白能顯著調節骨質疏松癥大鼠骨代謝，抑制高骨轉換速率，防止骨丟失。其抗骨質疏松癥的作用機制可能與RANKL/OPG比值下調相關，但其具體的作用機制有待進一步研究。

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