南瓜皮粗多糖對小鼠抗疲勞功效研究

王 強，龍 潔，李貴節，王 存

（1.重慶第二師范學院生物與化學工程系，重慶 400067；2.重慶第二師范學院教務處，重慶 400067）

南瓜（Cucurbita moschata Duch.）屬于葫蘆科（Cucurbitaceae）南瓜屬（Cucurbita）的一年生蔓生草本植物，是一種重要的蔬菜作物，其富含氨基酸、維生素、胡蘿卜素、礦物質、脂肪酸和色素等生物活性成分，并且鈉含量較低，是一種優質的功效成分提取資源[1-4]。中醫認為，南瓜味苦、性寒，可消炎、止痛、強肝、助腎、降低血壓、為產婦催奶、補中益氣。國內外研究表明[5-6]，南瓜對糖尿病、特別是Ⅱ型糖尿病具有顯著的療效，并可預防由糖尿病引起的腎病、肝病、高血脂和高血壓等疾病的發生，這使南瓜作為一種特效營養保健食品備受人們的重視?，F代醫學和營養學的研究表明南瓜中的活性多糖具有調節機體血糖水平等功能[7-8]，已成為當前醫藥和食品領域研究與開發的熱點。此外，包曉瑋等[9]研究發現，南瓜多糖能提高小鼠免疫器官質量、巨噬細胞的吞噬功能，揭示南瓜多糖具有免疫調節作用。王傳棟等[10]探討南瓜多糖體內體外的抗腫瘤作用以及對紅細胞免疫功能的影響，結果顯示南瓜多糖可增強紅細胞免疫吸附能力，具有一定的抗腫瘤及提高免疫活性的作用。

南瓜皮，作為南瓜深加工過程中產生的廢棄物，富含多糖和果膠等功能成分。我國每年利用的南瓜籽數千噸，但對南瓜皮資源的利用十分有限[11-13]。若將這些廢棄的南瓜皮作為生產多糖的原料，將會產生大量的優質南瓜皮粗多糖（pumpkin peel polysaccharides，PPPs）[14-16]。因此，本實驗研究PPPs對小鼠抗疲勞能力的影響，以豐富PPPs在提高機體抗疲勞能力方面的證據，為PPPs的抗疲勞研究及其相關產品的應用開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南瓜：新鮮，無病蟲害，購于市場；SPF級小鼠（許可證號：SCXK（渝）2007-0002）50 只，體質量18～22 g，由第三軍醫大學提供。

D-半乳糖 美國Sigma-Aldrich公司；血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒、血乳酸（blood lactic acid，BLA）試劑盒、肝糖原（hepatic glycogen，HG）試劑盒、肌糖原（muscle glycogen，MG）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、血乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產分析純；所用水為雙蒸水，所用其他溶液均自行配制。

DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱、DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海齊欣科學儀器有限公司；超聲波 寧波新芝生物科技有限責任公司；UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；冷凍離心機 美國貝克曼公司；LSC真空冷凍干燥機 德國Martin Christ公司。

1.2 方法

1.2.1 PPPs的制備

選擇成熟的南瓜作為原料，將原料清洗、削皮；將南瓜皮干燥（65℃）至水分含量8%；粉碎機粉碎，過60目篩。用95%的乙醇40℃熱處理1 h，再重復1次，以除去單糖、低聚糖和色素等小分子物質，同時滅酶活以防止在提取過程中多糖的降解。抽濾、濃縮、干燥，得到預處理原料。預處理后的南瓜皮粉于95℃熱水提取兩次（料液比為25∶1（m/V），2 h/次）→離心（3 000 r/min、10 min）→合并上清液→95%乙醇、100%乙醇、丙酮分別處理，4℃放置24 h→離心（3 000 r/min、10 min）→溶解，Sevag方法脫蛋白[17]（8次）→透析→冷凍干燥→PPPs。

1.2.2 實驗動物條件和分組

實驗小鼠飼養條件為：溫度18～22℃、相對濕度45%～55%，自然光照，自由采食和飲水。實驗前將50只小鼠在實驗環境下給予基礎飼料飼養1周，按體質量隨機分成5 組（雌雄各半，每組小鼠平均體質量相差＜2 g），分別是正常對照組（CN）、衰老模型對照組（DC）、多糖低、中、高劑量組（PPPs-L、PPPs-M、PPPs-H）。CN組腹腔注射100 mg/（kg·d）生理鹽水，其余4 組腹腔注射100 mg/（kg·d）D-半乳糖，實驗周期60 d。從實驗第41天開始，CN和DC組灌胃蒸餾水，多糖低、中和高劑量組腹腔注射D-半乳糖的同時灌胃125、250、500 mg/（kg·d）劑量的PPPs，連續給藥20 d。各組給予基礎飼料和自由飲水。

1.2.3 力竭游泳實驗

末次給藥30 min后，給予小鼠尾部負重相當于自重5%的鉛絲，將各組小鼠分別放入10個恒溫水池箱，水深（20±5） cm、水溫（25±1）℃，進行力竭游泳實驗。放入后立即計時，觀察小鼠游泳情況，并適時用玻璃棒撥動小鼠使其始終處于運動狀態。小鼠自開始到沉于水面下8 s后不能浮出水面的時間作為力竭游泳時間（min）。

1.2.4 測試樣品的制備和檢測

力竭游泳實驗后，斷頭取血致死，收集血液，4 000 r/min離心10 min，上清液備用。所有處理均在4℃條件下完成。

用BUN、BLA、HG、MG、MDA和SOD及LDH試劑盒結合紫外-可見分光光度計分別測定。

1.3 數據分析

采用SPSS 15數據處理軟件，各組數據結果均以±s（n=10）表示，并進行方差分析，LSD法多重比較，P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結果與分析

2.1 PPPs對衰老小鼠力竭游泳時間的影響

疲勞是一種常見的生理現象，其過程為過度勞動或運動引起機體生理生化功能改變而導致機體勞動或運動能力的暫時降低，實際上疲勞是防止機體發生機能衰竭而產生的一種保護性反應。疲勞可以導致精神不振、注意力不集中、抵抗力下降等一系列后果，嚴重影響工作效率或運動成績，故研究延緩或消除疲勞的措施具有十分重要的意義[18-19]。

D-半乳糖衰老模型在國內外被廣泛用于衰老機理研究和抗疲勞藥物的藥效學評價[20]。PPPs對衰老小鼠游泳時間的影響見圖1。正常對照組和不同多糖劑量組小鼠力竭游泳時間均高于衰老模型組，PPPs-L組與衰老模型對照組差異不顯著（P＞0.05），其余均達到顯著水平（P＜0.05）；并且衰老小鼠力竭游泳時間與多糖劑量成正相關，而且PPPs-M和PPPs-H組的小鼠力竭游泳時間均高于正常對照組，其中，PPPs-H組比正常對照組提高了21.6%（P＜0.05）。結果說明南瓜皮多糖可顯著提高衰老小鼠的運動能力，延緩疲勞的發生。

圖1 PPPs對衰老小鼠力竭游泳時間的影響Fig.1 Effect of PPPs on exhaustive swimming time in aged mice

2.2 PPPs對衰老小鼠相關生理指標的影響

能量物質的消耗、代謝物質的堆積是產生疲勞的重要原因[21]。常用的疲勞的評價方法主要有兩個：運動耐力實驗和生化指標的檢測。在反映疲勞的生化指標中，血尿素氮（BUN）、血乳酸（BLA）和糖原等生化指標的改變最具代表性，也是檢測疲勞最常用的指標[22]。當糖原被大量消耗時，機體活動能力降低，從而導致全身性疲勞的發生。糖原貯備的提高有利于機體耐力速度的提高，并減少蛋白質和含氮化合物的分解代謝。

表1 PPPs對衰老小鼠的相關生理指標影響Table1 Effect of PPs on physiological indexes in aged mice

由表1可知，不同多糖劑量組小鼠BUN和BLA含量均顯著低于衰老模型對照組（P＜0.05），PPPs低、中和高劑量組BUN含量分別比衰老模型對照組降低了10.3%、15.9%和23.9%，呈顯著差異（P＜0.05），并且PPPs中和高劑量組對BUN含量的降低效果與正常對照組相比沒有顯著差異（P＞0.05）；PPPs低、中、高劑量組BLA含量分別比衰老模型對照組降低了18.7%、22.4%、33.8%，呈顯著差異（P＜0.05），并且PPPs低、中、高劑量組對BLA含量的降低效果與正常對照組相比沒有顯著差異（P＞0.05）。由表1還可以看出，低、中、高3個劑量組的肝糖原和肌糖原含量均高于正常對照組；其中，與正常對照組相比，中、高劑量組肝糖原和肌糖原的含量均顯著性增加，說明PPPs可以增加糖原的儲備，為機體提供能量，延緩疲勞產生。國內外研究發現，機體疲勞時，會發生相應的生化改變，包括糖原儲備量降低、血尿素氮和血乳酸水平升高等[21-22]。體內的糖原是運動時能量的來源，糖原儲備充足，供應的能量就多，抗疲勞能力就強。因此糖原的含量能說明疲勞發生的快慢或程度，當機體劇烈運動時細胞相對缺氧，糖酵解加快、產生大量乳酸，清除肌肉中過多的乳酸，可延緩和消除疲勞[23]。此外，機體劇烈運動時，蛋白質及氨基酸的分解代謝增強，氨基酸會代謝轉化生成尿素進入血液，使血尿素含量增加，與血乳酸一樣，血尿素氮也是疲勞時肌肉酸痛的主要原因[19,24]。

表2 PPPs對衰老小鼠MDA含量、SOD及LDH活力的影響Table2 Effect of PPs on the contents of MDA, SOD and LDH in the blood of aged mice

表2顯示PPPs對衰老小鼠的脂質過氧化水平（丙二醛）和血清抗氧化狀態的影響，PPPs低、中和高劑量組與衰老模型對照組相比，血清MDA含量分別降低了10.3%、19.3%和27.7%，并且PPPs中和高劑量組對MDA含量的降低效果與正常對照組相比沒有顯著差異（P＞0.05）。與衰老模型對照組相比，PPPs低、中和高劑量組的血清SOD活性顯著提高（P＜0.05），PPPs高劑量組的血清SOD活性與正常對照組相比沒有顯著差異。表2中的結果還表明，與衰老模型對照組相比，PPPs低、中和高劑量組的血LDH活性顯著提高（P＜0.05），并且PPPs中、高劑量組的血LDH活性與正常對照組相比顯著提高。本實驗結果表明，PPPs具有良好的體內抗氧化活性，可顯著提高體內抗氧化系統酶活力，增強體內抗氧化防護能力，清除體內氧自由基，防止細胞膜脂質過氧化，有效預防動物細胞自由基損傷，可能是其具有抗疲勞作用的主要機制所在。

本實驗結果表明，南瓜皮粗多糖具有良好的體內抗氧化活性和抑制脂質過氧化能力，可顯著提高體內抗氧化系統酶活力，增強體內抗氧化防護能力，清除體內氧自由基，防止細胞膜脂質過氧化，有效預防動物細胞自由基損傷，可能是其具有抗疲勞作用的主要機制所在。

3 結 論

疲勞是由運動引起機體一系列生化改變而導致的肌肉力量的降低。評價疲勞的方法包括耐力實驗和生化指標的檢測。通過小鼠耐力實驗不難發現，PPPs-H高劑量組比正常對照組運動耐力時間延遲了21.6%（P＜0.05）。不僅如此，PPPs-H組還有效增加了衰老小鼠SOD及LDH活性，顯著降低小鼠劇烈運動后血尿素氮、血乳酸和MDA含量，顯示出PPPs-H具有延長小鼠運動耐力的作用。

此外，長時間運動后，機體為維持血糖水平，肝糖原會下降，因此糖原含量也是檢測抗疲勞作用的重要指標之一。本實驗證實，PPPs高、中、低3個劑量組的肝糖原和肌糖原含量均高于正常對照組；其中，與正常對照組相比，PPPs中、高劑量組肝糖原和肌糖原的含量均顯著性增加（P＜0.05），說明PPPs可以增加糖原的儲備，為肌體提供能量，延緩疲勞產生。盡管南瓜皮粗多糖能夠提高小鼠的運動能力，顯著改善了脂質過氧化水平和血清抗氧化狀態，但有關其具體的抗疲勞機理以及構效關系仍需進一步研究。

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