巴豆生物堿對人胃癌SGC-7901細胞PCNA、Ki-67及Bax、Fas表達的影響

宋紅春 谷 雨 陸為民 耿燕楠

（1.南京中醫藥大學，江蘇南京210029；2.江蘇省中醫院，江蘇南京210029）

巴豆，系大戟科植物巴豆的種子，味辛，性熱。巴豆從很早之前就被用于抗腫瘤治療，巴豆制劑及其復方對胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌等多種腫瘤的治療作用已從化學、藥理、臨床等多方面研究確定。有實驗研究證實，巴豆生物堿（CA）能誘導SGC-7901細胞分化，抑制細胞增殖，并誘導其凋亡[1-4]。本文即從體外實驗的角度，初步探討巴豆生物堿抑制SGC-7901細胞增殖及誘導其凋亡的分子機制。

1 實驗材料

1.1 細胞株 人胃癌SGC-7901細胞株購自南京凱基生物科技發展有限公司。

1.2 藥物與試劑 巴豆生物堿由中國藥科大學藥理室制備；RPMI 1640培養基、小牛血清、胰蛋白酶購自南京凱基生物科技發展有限公司；免疫組化相關抗體試劑盒購自Bioworld公司；免疫組化MaxVisionTM試劑盒、DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物公司。

1.3 實驗儀器 細胞培養瓶、培養板：Fisher Scientific公司（美國）；微量加樣器：Eppendorf公司（德國）；二氧化碳培養箱：3111型，Thermo公司（美國）；臺式離心機：80-2型，上海醫療器械 （集團）有限公司；光學顯微鏡：LEICA DM-1000型，LEICA公司（德國）；MiniSee圖像采集系統：康克新柏圖文分析軟件。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 SGC-7901細胞接種于含10%滅活小牛血清的 RPMI 1640培養液中，置 37℃、5%CO2培養箱中培養，每日顯微鏡下觀察，待細胞生長狀態良好，鋪滿瓶底時，用0.25%胰蛋白酶溶液常規消化、傳代。

2.2 免疫組化法檢測巴豆生物堿對SGC-7901細胞PCNA、Ki-67、Bax及Fas表達的影響 取處于對數生長期細胞，調整細胞濃度為1×105/mL，以2000μL每孔接種于6孔塑料板，6孔塑料板每孔底部交錯放置兩塊24mm×24mm經多聚賴氨酸處理的無菌蓋玻片，置37℃、5%CO2培養箱中培養。待培養24h細胞貼壁后，吸棄舊培養液，每孔加入1000μL不同濃度的巴豆生物堿，使終濃度為 25、50、100、200、400μg/mL，并設 0μg/mL 的空白對照，每個濃度設 3 個復孔。繼續培養72h后，取出蓋玻片，PBS沖洗，4%多聚甲醛4℃固定過夜，3%H2O2室溫孵育20min，滴加一抗4℃過夜，次日滴加二抗，最后DAB顯色，蘇木素輕染，脫水，透明，封片。

每張細胞片選取6個不同視野在高倍鏡下觀察，以此來判斷細胞染色的著色率。PCNA和Ki-67陽性判斷標準是以細胞核出現淡黃色至棕黃色顆粒沉著為陽性細胞，而Bax和Fas主要以胞漿出現淡黃色至棕黃色顆粒沉著為陽性細胞。染色結果以染色陽性細胞數百分比計算，即在觀察的高倍視野中，計數100個細胞中陽性細胞所占百分比，并取6個視野的平均值。

2.3 統計學方法 實驗重復3次，結果以（x±s）表示。所有數據均采用SPSS16.0統計分析軟件進行方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 實驗結果

如圖1和圖2中所見，PCNA、Ki-67蛋白主要在胞核中表達，并隨著巴豆生物堿濃度的升高，PCNA和Ki-67蛋白表達陽性率降低。如圖3和圖4中所見，Bax和Fas蛋白表達主要在胞漿中，隨著巴豆生物堿濃度的升高，Bax及Fas表達顯著增多。見表1。

圖1 免疫組化SGC-7901細胞中PCNA蛋白的表達（10×40）

圖2 免疫組化SGC-7901細胞中Ki-67蛋白的表達（10×40）

圖3 免疫組化SGC-7901細胞中Bax蛋白的表達（10×40）

圖4 免疫組化SGC-7901細胞中Fas蛋白的表達（10×40）

表1 各組SGC-7901細胞中PCNA、Ki-67、Bax、Fas蛋白表達陽性率（x±s） %

4 討論

目前，胃癌的治療仍以手術治療為主，聯合放化療，然而仍有部分患者不適宜手術，傳統化療藥物有嚴重的不良反應和化療耐藥，多藥耐藥是造成腫瘤化療失敗的重要原因之一。因此，研究中藥對于腫瘤的作用，開發新型有效的抗腫瘤藥物具有廣闊的前景。近年來，生物堿類藥物在腫瘤防治方面的作用越來越受到人們的重視。

目前認為腫瘤的發生發展與細胞增殖失控和細胞凋亡失衡有關。PCNA、Ki-67是與細胞增殖相關的核抗原，在增殖的細胞中呈陽性表達，反映細胞的增殖活性，是細胞增殖的重要標記物[5-6]。PCNA為S期廣泛表達的酸性蛋白，定位于細胞核，S期高水平表達，而在M期和G0期不表達。因此PCNA的陽性程度可直接反映DNA復制的活躍程度。Ki-67表達在G0期和G1早期缺如，在S、G2和M期等細胞中均有表達，其表達活性隨細胞周期進展而增加，可準確地反映細胞增殖活性。本研究免疫組化結果顯示，隨著巴豆生物堿作用濃度的升高，SGC-7901細胞中PCNA、Ki-67表達下降，表明巴豆生物堿抑制SGC-7901細胞增殖的作用機制與其下調PCNA、Ki-67表達相關，并呈濃度依賴性。腫瘤惡性程度與其細胞的增殖速度密切相關，細胞增殖活躍者，其生物學行為不佳，預后不良。巴豆生物堿可抑制SGC-7901細胞的增殖，表明其可一定程度地抑制胃癌的分化和轉移，改善預后。

細胞凋亡，又稱程序性細胞死亡，是一種細胞自主的生理性死亡。細胞凋亡與機體清除病毒、抗腫瘤及腫瘤形成均有密切關系，Bcl-2家族蛋白和Fas/FasL系統是重要的凋亡調節因子。根據在細胞凋亡調控中的不同作用，Bcl-2蛋白家族分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白兩大類。bax是bcl-2家族中主要的促凋亡蛋白，bax定位于細胞漿，自身可形成同源二聚體或與bcl-2形成異源二聚體。當bax過度表達時，bax本身形成的同源二聚體占主導，則易于發生凋亡[7]。很多細胞凋亡中有bax表達升高，其能通過直接影響線粒體功能和膜的完整性而調節凋亡，并降低細胞凋亡的閾值[8]。bax促進細胞凋亡的機理主要有線粒體滲透性轉換、氧化磷酸化和ATP的合成功能被破壞；細胞氧化還原作用改變；線粒體中的凋亡相關分子Apaf-1釋放出來，與細胞色素C相互作用，激活胱冬肽酶（caspase）信號轉導途徑。有研究表明bax表達與腫瘤發生發展過程呈負相關，bax在癌組織中的表達隨著病理分級、臨床分期的增高而降低，且bax在淋巴結轉移的患者中低表達[7]。本研究免疫組化結果顯示，巴豆生物堿可調高SGC-7901細胞bax蛋白的表達，并呈濃度依賴性，表明巴豆生物堿可能通過上調bax的表達，促進SGC-7901細胞凋亡，從而抑制胃癌的發生與發展。

Fas是有關細胞凋亡的膜表面分子，是Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員。FasL是Fas配體，屬于TNF家族Ⅱ型跨膜蛋白。Fas一旦和其配體FasL結合，誘導Fas形成能傳遞信號的活性形式Fas三聚體，其中的死亡域可與一種死亡結構域相關蛋白結合，并將凋亡信號傳遞給caspase-8，caspase-8的激活將產生一系列連鎖反應，誘導細胞凋亡[9]。本實驗結果表明，隨著巴豆生物堿濃度的升高，SGC-7901細胞中Fas表達增多，表明巴豆生物堿能上調SGC-7901細胞Fas的表達，并呈濃度依賴性，說明巴豆生物堿誘導SGC-7901細胞凋亡的作用機制可能與此相關。

胃癌的發生與發展受多基因、多途徑的調控，各種因素可協同或拮抗發揮調節作用。本研究從體外角度發現巴豆生物堿對SGC-7901細胞的增殖抑制及誘導凋亡作用與其下調PCNA、Ki-67表達及上調bax、Fas表達相關。這為我們進一步研究巴豆生物堿抗腫瘤的分子機制打下基礎，并為臨床應用提供了一定的依據，在胃癌的治療方面，巴豆生物堿可能成為一種有潛在應用前景的抗腫瘤藥物。

[1] 狄洌，許冬青，王明艷，等.巴豆生物堿對人胃癌細胞SGC-7901 p53 基因表達的影響.遼寧中醫雜志，2003，30（12）：1019

[2] 趙鳳鳴，許冬青，王明艷，等.巴豆生物堿對人胃癌細胞SGC-7901 的誘導分化作用研究.中醫藥學刊，2005，23（1）：134

[3] 許冬青，王明艷，瞿融.巴豆生物堿對人胃腺癌細胞SGC-7901 Fas基因表達影響的研究.中醫藥學報，2005，33（2）：9

[4] 王明艷，瞿融，許冬青.巴豆生物堿誘導人胃腺癌SGC-7901細胞凋亡的研究.南京中醫藥大學學報，2010，26（5）：368

[5] 錢金方.增殖細胞核抗原在常見腫瘤的研究進展.腫瘤基礎與臨床，2008，21（1）：86

[6] 馬文群，李利敏，宋國智.增殖細胞核抗原與腫瘤關系的研究進展.河北醫藥，2011，33（4）：600

[7] 楊連君.bcl-2，bax與腫瘤細胞凋亡.中國腫瘤生物治療雜志，2003，10（3）：232

[8] Jrgensmeier JM，Xie Z，Deveraux Q，et al.Bax directly induces release of cytochrome C from isolated mitochondria.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（9）：4997

[9] 陸茜，李寧麗.Fas介導細胞凋亡及相關免疫調節作用.細胞生物學雜志，2006，28（4）：543