PreIQ及其突變體載體構建表達純化和活性鑒定

孫威，封瑞，2，郭鳳，2，趙金生，2，趙美瞇，2，高青華，2，王紅梅 ，毛楠，郝麗英，2

（中國醫科大學1.藥學院藥物毒理學教研室；2.心血管研究所，沈陽 110001）

PreIQ及其突變體載體構建表達純化和活性鑒定

孫威1，封瑞1，2，郭鳳1，2，趙金生1，2，趙美瞇1，2，高青華1，2，王紅梅1，毛楠1，郝麗英1，2

（中國醫科大學1.藥學院藥物毒理學教研室；2.心血管研究所，沈陽 110001）

目的構建心肌L型鈣通道片段PreIQ及其突變體與谷胱甘肽轉移酶（GST）重組的融合蛋白原核表達載體并進行表達純化和活性鑒定。方法 將PreIQ及其突變體的cDNA插入pGEX?6p?1質粒載體后，轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，大量培養并利用異丙基硫代?β?D半乳糖苷（IPTG）誘導PreIQ及其突變體的GST融合蛋白表達，GS?4Bbeads進行分離純化。采用SDS?PAGE鑒定目的蛋白分子質量和相對純度。采用Bradford方法測定純化后蛋白濃度。采用pull?down法檢測純化后蛋白的活性。結果 PreIQ及其突變體融合蛋白得到了大量表達；純化的PreIQ及其突變體具有較高的純度；純化后蛋白能與鈣調蛋白（CaM）結合，具有生物活性。結論 本研究成功構建了PreIQ及其突變體融合蛋白原核表達載體，獲得具有生物活性的PreIQ及其突變體融合蛋白，為深入研究PreIQ的生能學功能奠定基礎。

融合蛋白；PreIQ；突變體；pull?down

鈣離子參與多種生理過程，如鈣穩態調節、肌肉興奮收縮［1］、神經遞質釋放、細胞生長增值、心臟傳導、基因表達和激素分泌等。鈣通道廣泛存在于機體的各種類型細胞中，并且在不同的組織細胞，或同一組織細胞不同部位其鈣通道的類型也各不相同。根據鈣通道開閉的因素，將鈣通道分為5類，其中一大類為電壓依賴型鈣通道（voltage?depen?dent calcium channel，VDCC）。按照激活閾值的高低又分為高電壓激活鈣通道（high?voltage activated Ca2+channel，HVACa2+通道）和低電壓激活鈣通道（low?voltage activated Ca2+channel，LVACa2+通道），其中高電壓激活鈣通道包括L、N、P/Q及R型鈣通道。其膜電位低，激活前膜需要去極化。本文構建的preIQ及其突變體融合蛋白即屬于L型高電壓激活鈣通道。

鈣通道是由α1亞單位和α2/δ、β、γ幾個輔助亞單位構成的復合體［2］，由多基因編碼。不同類型鈣通道α1亞單位的編碼基因多有不同，其中，L型鈣通道結構為α1C、α1D和α1S。α1亞單位在細胞膜上形成4個跨膜區域（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ）。每個跨膜區域有6個螺旋肽段（S1～S6）及其間的連接肽鏈組成。α1C的羧基末端在細胞膜內側，自動調節Cav1.2的轉錄［3］。本文中合成的PreIQ融合蛋白正是L型鈣通道α1C亞基羧基末端的的一段蛋白，氨基酸序列為1599?1639，見圖1。

圖1 Cavl.2的結構示意圖以及PrelQ及其突變體的氨基酸序列Fig.1 Schematic illustrations of the peptides of Cavl.2and Sequences of PrelQand its mutant

近年來人們發現當細胞受到某種刺激后，L型鈣通道開放，增加的鈣離子對L型鈣通道能產生兩個互為相反的自身反饋調節，即鈣依賴性失活和激活。鈣調蛋白（calmodulin，CaM）作為一種鈣離子敏感器，能與L型鈣通道上的PreIQ結合，在上述過程中發揮重要作用。為了更好的研究細胞內因子CaM是如何與PreIQ作用的，影響二者作用的因素有哪些，我們急需構建PreIQ及其突變體的融合蛋白，提純這種蛋白單體用到后續的實驗當中。故本文主要講述如何構建L型鈣通道上PreIQ及其突變體融合蛋白質粒，如何表達純化這種蛋白單體，并用實驗證明提純后蛋白單體具有生物學活性。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEX?6p?1/PreIQ和pGEX?6p?1/PreIQ突變體（圖1）質粒由上海生工生物工程股份有限公司合成；異丙基硫代?β?D半乳糖苷（isopropyl thiogalacto?side，IPTG）、溶菌酶（lysozyme，LYS）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、N?十二烷基肌氨酸鈉（N?lauryl sarcosine，N?Lau）、氨芐西林（ampicillin，Amp）均購自Sigma公司；PreScission Protease和GS?4Bbeads購自GEHealthcare公司；胰蛋白胨、酵母提取物購自OXOID公司；其他試劑均購自BIOSHARP公司。

1.2 質粒DNA轉化和提取

1.2.1 BL21感受態細胞的轉化

應用42℃精確熱激法進行感受態細胞的轉化。精確量取pGEX?6p?1/PreIQ質粒10ng，加入E.coliBL21100μL，2mL離心管中輕輕混勻，冰浴30min，42℃水浴60s，快速轉移至冰浴中，冷卻2min。加入無菌SOC培養基1mL（胰蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 8.5mmol/L，KCl 2.5mmol/L，MgCl210mmol/L，葡萄糖20mmol/L），混勻置37℃水浴振蕩器中培養1h，轉速為120r/min。4000r/min離心2min，去除部分上清，懸浮沉淀的菌體約200μL加在含Amp 0.1g/L的LB固體瓊脂培養板上，無菌條件下涂抹均勻。待培養板將懸浮菌液吸收后，轉移至電熱恒溫培養箱中，倒置培養12～16h。1.2.2 質粒提取

經含AMP0.1g/L的瓊脂平板篩選后，取單克隆菌種接種于裝有含AMP0.1g/L的LB培養液3mL離心管中，37℃、120r/min培養12～16h。取菌液1mL（其余的菌液按菌液：50%甘油比例為4∶1凍存于-80℃冰箱中），15000r/min，4℃離心10min，棄上清；加冰預冷的堿裂解液Ⅰ250μL，劇烈渦旋使分散均勻；加新配制的堿裂解液Ⅱ250μL混勻；加冰預冷的堿裂解液Ⅲ350μL混勻，冰浴3～5min；4℃，15000r/min離心10min，轉移上清置另一離心管中；加等體積的酚?氯仿（1∶1），振蕩混合，室溫放置2min；4℃，15000r/min離心10min，棄上清，加70%乙醇1mL，反復混勻，4℃，15000r/min離心2min，室溫放置10～15min直至乙醇完全揮發；用去離子水重新溶解核酸，溫和振蕩數秒，-80℃保存。取部分再次用去離子水稀釋，測質粒的吸光度值，直至稀釋到500ng/μL。

1.3 PreIQ及其突變體質粒的DNA鑒定

1.3.1 質粒DNA的酶切鑒定

該質粒具有BamHⅠ和XhoⅠ兩個限制性酶切位點。質粒DNA經雙酶切后，瓊脂糖電泳進行鑒定。

1.3.2 質粒的DNA測序

將-80℃保存的1mL菌液送到公司進行DNA測序。

1.4 融合蛋白的表達及純化

1.4.1 融合蛋白表達：取400μL菌種加入到裝有400mLLB培養液的錐形瓶中，37℃、100r/min振搖培養12～16h。當A600在0.8左右時，加入IPTG至1mmol/L，37℃，120r/min振搖培養4h，誘導融合蛋白大量表達。

1.4.2 融合蛋白的純化：以下操作均在冰上進行，離心均采用4℃離心機。菌液4000r/min離心8min，棄上清，用磷酸鹽緩沖液（phosphate bufer，PBS）20mL重懸沉淀菌體，加入20mg/mL的LYS和1mol/L的DTT各100μL、15%的N?Lau 2mL，混勻冰上放置30min，用超聲波細胞粉碎機超3s停7s，4℃共5min。后加入30%TritonX?100666.67μL，冰上放置30min，14000r/min離心8min，棄沉淀。每10mL上清與250μLGS?4Bbeads 4℃結合過夜（beads用PBS洗3遍，600r/min，離心3min）。第2天用PBS溫柔清洗beads，每次5mL，600r/min離心3min洗3次，4℃保存。待測蛋白濃度。

1.5 純化后蛋白純度和濃度測定

1.5.1 PreIQ及其突變體的純度測定：15%SDS?PAGE電泳檢測純化的PreIQ及其突變體的相對分子量和純度。

1.5.2 PreIQ及其突變體的濃度測定：參照Bradford蛋白濃度測定試劑盒說明測定PreIQ及其突變體的濃度。

1.6 PreIQ及其突變體的活性鑒定

用Pull?down的方法檢測純化后的PreIQ及其突變體的活性。具體方法為40μL的PreIQ及其突變體分別和30μL的CaM在300μL的Internal solution（aspartic acid 120mmol/L，KOH120mmol/L，KCl 24mmol/L，MgCl23.5mmol/L，HEPES10mmol/L，Na2ATP3mmol/L，EGTA1mmol/L，CaCl20.58mmol/L）中結合，旋轉培養器4℃結合4h；用PBS溫柔清洗beads，每次600μL，600r/min離心3min洗2次；棄上清得beads；15%SDS?PAGE電泳檢測PreIQ及其突變體與CaM結合的情況，以了解純化后的蛋白是否具有生物活性。

2 結果

2.1 重組質粒的酶切鑒定

鑒定插入PreIQ或PreIQ突變體的pGEX?6p?1載體的質粒。質粒pGEX?6p?1經BmaxHⅠ和XhoⅠ雙酶切插入PreIQ或PreIQ突變體。質粒pGEX?6p?1約為4900bp，BmaxHⅠ和XhoⅠ之間的堿基全長為24bp，PreIQ或其突變體約為120bp，故PreIQ及其突變體的重組質粒全長約為4900-24+120=4996bp。重組質粒后經BmaxHⅠ和XhoⅠ雙酶切應該得到一個大分子量約為4876bp的DNA片段和一個小分子量約為120bp的DNA片段。瓊脂糖電泳結果發現不管是PeIQ還是其突變體的酶切圖譜上，在約4876bp和120bp處都有一明顯條帶（圖2），結果與預計相符，說明PreIQ及其突變體融合蛋白質粒均構建成功。

2.2 PreIQ及其突變體的DNA測序結果

圖2 PrelQ及其突變體質粒的酶切鑒定瓊脂糖電泳圖Fig.2 Agarose electrodhoresis of PrelQand its mutnat plasmid digested by restriction endonucIease

DNA測序結果顯示PreIQ重組質粒是含有120bp的DNA片段，基因同一性比較為100%，氨基酸同一性比較為100%，且插入方向正確，讀碼框架正確，無移碼突變，見圖3，進一步證明本文構建重組質粒獲得成功。

圖3 PrelQ及其突變體重組質粒的DNA測序結果Fig.3 The DNAsequence identification of GST?PreIQand its mutant

2.3 純化后蛋白的純度和濃度測定

GST蛋白的表觀分子質量約為26kDa，PreIQ及其突變體的序列都含有40個氨基酸，表觀分子質量約為4kDa。PreIQ及其突變體融合蛋白表觀分子質量約為30kDa。結果顯示，在表觀分子質量約30kDa處出現一條粗蛋白條帶，純度高，表達量大，此條帶即為PreIQ及其突變體的融合蛋白條帶，與預期結果一致；在表觀分子質量約26kDa處出現一條細蛋白條帶，表達量小，此條帶認為是GST蛋白條帶，見圖4。初步認定提純獲得PreIQ及其突變體的GST融合蛋白。

圖4 純化后GST?PrelQ及其突變體蛋白SDS?PAGE圖Fig.4 SDS?PAGEof purification GST?PreIQand its mutant

采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒方法測定提純后的蛋白濃度，結果發現PreIQ重組蛋白和PreIQ突變體重組蛋白的濃度分別為2.24和2.05mg/mL。

2.4 PreIQ及其突變體融合蛋白的活性鑒定

應用pull?down微量蛋白結合法，得到結果，見圖5，當提純后的PreIQ與CaM結合時，在表觀分子量18kDa出現一條蛋白條帶，說明本實驗提純后得到的PreIQ能與CaM結合，這一結果與某些國外的報道一致［4，5］；當提純后的PreIQ突變體與CaM結合時，結合量很少，可以忽略不計，在表觀分子量18kDa處只出現一條很弱的條帶，說明本實驗提純后的PreIQ突變體不能與CaM結合［2］。以上的結果說明本實驗提純后得到的PreIQ及其突變體的GST融合蛋白都具有生物活性。

圖5 GST?PreIQ及其突變體與鈣調蛋白（CaM）結合的SDS?PAGE圖Fig.5 SDS?PAGEof CaMbinding with GST?PrelQand mutant GST?PrelQ

3 討論

近期研究發現鈣離子結合蛋白1（caldendrin，CaBP1）的一種突變體，能與PreIQ結合介導鈣離子的負反饋調節，即鈣依賴性失活（Ca2+dependent in?activation，CDI）［6］。Ca2+/CaM有兩個臂（C?lobe和N?lobe），C?lobe也能與PreIQ結合［7］。與IQ基序相比，CaM與通道PreIQ的親和力較弱［2］。也有報道稱Cav1.2上EF和IQ基序間標簽肽C、CB和PreIQ都能與CaM結合介導CDI。近年來人們在研究通道結合蛋白的作用機制中，經常應用到Cav1.2的PreIQ及其突變體的融合蛋白片段，本實驗室構建了PreIQ及其突變體的GST融合蛋白的質粒，將其轉化到大腸桿菌中，誘導蛋白大量表達，為Cav1.2α1C亞單位上PreIQ及其突變體融合蛋白的純化提供方法。

原核表達系統發展完善、流程簡單快速、成本低、產量高，尤其適宜于表達原核來源的以及不需要翻譯后修飾的真核蛋白。但在表達具體某種蛋白時，我們需要對表達條件進行相應的優化，以獲得高純度，高表達量的融合蛋白。本實驗應用雙酶切和DNA測序這兩種方法完成了PreIQ及其突變體融合蛋白質粒的鑒定；并用SDS?PAGE電泳法確定純化后蛋白的純度，證明本方法獲得的蛋白純度高；使用Bradford法測定了純化后蛋白的濃度，結果發現本方法提純后的蛋白濃度高，為后續的實驗順利進行提供了可能性；應用Pull?down法發現提純后的融合蛋白也具有生物活性。綜上所述，采用本方法可穩定獲得高純度高濃度并具有生物活性的Pre?IQ及其突變體蛋白，為后續深入研究Cav1.2上Pre?IQ基序的生物學功能奠定了基礎。

［1］Hulme JT，Yarov?Yarovoy V，Lin TW，et al.Autoinhibitory control of the CaV1.2channel by its proteolytically processed distal C?ter?minal domain［J］.JPhysiol，2006，576（Pt 1）：87-102.

［2］Asmara H，Minobe E，Saud ZA，et al.Interactions of calmodulin with the multiple binding sites of Cav1.2Ca2+channels［J］.JPhar?macol Sci，2010，112（4）：397-404.

［3］Schroder E，Byse M，Satin J.L?type calcium channel Cterminus au?toregulates transcription［J］.Circ Res，2009，104（12）：1373-1381.

［4］Minobe E，Asmara H，Saud ZA，et al.Calpastatin domain Lis a par?tial agonist of the calmodulin?binding site for channel activation in Cav1.2Ca2+channels［J］.JBiol Chem，2011，286（45）：39013-39022.

［5］Kim EY，Rumpf CH，Van Petegem F，et al.Multiple C?terminal tail Ca（2+）/CaMs regulate Ca（V）1.2function but do not mediate chan?nel dimerization［J］.EMBOJ，2010，29（23）：3924-3938.

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（編輯 裘孝琦）

Vector Construction，Expression，Purificationand Identificationof PreI QandIts Mutant

SUNWei1，FENGRui1，2，GUOFeng1，2，ZHAOJin?sheng1，2，ZHAOMei?mi1，2，GAOQing?hua1，2，WANGHong?mei1，MAONan1，HAOLi?ying1，2
（1.Department of Pharmaceutical Toxicology，School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Cardiovascular Institute of China Medical University，Shenyang110001，China）

ObjectiveTo develop prokaryotic expression vectors for PreIQand its mutant GSTfusion protein expressions，purification and activity identification.MethodscDNAs of PreIQand its mutant were cloned into pGEX?6p?1plasmid vector，and then transformed to theEscherichia coliBL21component cells.The transformed BL21cells were stimulated with IPTGfor the expression of GSTfusion proteins with PreIQand its mutant.The fusion proteins were purified with Glutathione?Sepharose 4Bbeads.SDS?PAGEwas used to detect the purity and relative molecular weight.Bradford method was used to determine the concentration of purified PreIQand its mutant.The protein activity was examined by pull?down method.ResultsSDS?PAGEshowedhighpurityofPreIQanditsmutantwiththeconcentrationaround2mg/mL，whichwasenoughformolecularbiological and electrophysiological studies.The purified PreIQand its mutant in this study successfully bind to CaM.ConclusionProkaryotic expression vec?tors of PreIQand its mutant fusion proteins were successfully constructed，and bioactive fusion proteins were obtained.These results provided a basis forfurtherbiologicalfunctionstudiesofPreIQ.

fusion protein；PreIQ；mutant；pull?down

R966

A

0258-4646（2014）03-0293-04

http://www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20140429.1439.004.html

國家自然科學基金（31071004；81001429；81100108）

孫威（1985-），女，博士研究生.

郝麗英，E-mail：lyhao@mail.cmu.edu.cn

2013-12-03

網絡出版時間：2014-04-2914:39

·論著·