糖尿病合并肺結核患者肺部病灶組織中細胞因子的表達及意義

張放，楊飛

（1.中國醫科大學附屬第一醫院呼吸疾病研究所，沈陽 110001；2.沈陽市胸科醫院老年病科，沈陽 110044）

糖尿病合并肺結核患者肺部病灶組織中細胞因子的表達及意義

張放1，楊飛2

（1.中國醫科大學附屬第一醫院呼吸疾病研究所，沈陽 110001；2.沈陽市胸科醫院老年病科，沈陽 110044）

目的比較單一肺結核與糖尿病合并肺結核患者的肺部病灶組織中TNF?α、IFN?γ及IL?10的表達，探討肺結核、糖尿病合并肺結核患者的細胞免疫功能變化及其意義。方法 應用免疫組化SABC法檢測13例肺部良性病變患者、45例單一肺結核患者、15例糖尿病合并肺結核患者的肺部病灶組織中TNF?α、IFN?γ及IL?10的表達，并對陽性細胞的平均光密度（AOD）進行定量比較，AOD值采用秩變換后，進行方差分析，采用LSD檢驗方法進行兩兩比較。結果 TNF?α、IFN?γ及IL?10在壞死區周圍炎性反應帶表達明顯，糖尿病合并肺結核組中TNF?α、IFN?γ的AOD值低于肺結核組（P<0.05），而IL?10的AOD值高于肺結核組（P<0.05）；肺結核組TNFα、IFN?γ的AOD值高于對照組（P>0.05），而IL?10的AOD值低于對照組（P<0.05）。結論 TNF?α、IFN?γ、IL?10這些細胞因子參與了肺結核的局部免疫反應；糖尿病患者存在局部細胞免疫反應降低。調節糖尿病患者局部組織中的細胞因子，將可能成為糖尿病合并肺結核患者免疫治療的一種新的途徑。

TNF?α；IFN?γ；IL?10；糖尿病；肺結核

糖尿病患者易并發肺結核，其發病率大約為10%～15%，與非糖尿病患者比較，糖尿病患者感染肺結核的發病率是其2～5倍［1］。這可能與糖尿病患者的Th1型相關細胞因子及一氧化氮酶低表達，限制了宿主對結核分枝桿菌的免疫反應相關［2］。而在肺結核患者中，主要以Th1型細胞因子介導的細胞免疫為主，糖尿病患者的細胞免疫功能下降，使機體不易清除結核分枝桿菌。天然免疫細胞因子TNF?α、Th1型相關細胞因子IFN?γ，它們抗結核分枝桿菌的作用已得到認可［3，4］。而Th2型相關細胞因子IL?10，在結核分枝桿菌感染的過程中作用尚不完全確定。目前對糖尿病合并肺結核的研究多是關于血漿中各細胞因子的表達水平［5］，不能準確反應病灶的局部細胞免疫水平。本研究應用免疫組織化學方法對糖尿病合并肺結核患者肺部病灶組織中的TNF?α、IFN?γ、IL?10進行檢測，使人們進一步了解肺結核及糖尿病合并肺結核的局部免疫，探討糖尿病在肺結核患者中對細胞免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對象：選擇2009年4月至2010年9月在沈陽市胸科醫院住院并行肺葉切除術患者，男50例，女患23例，年齡25～66歲。

1.1.2 分組：（1）對照組：選取同期住院的其他肺部良性病變患者13例，男9例，女4例，年齡（50±6）歲，其中炎性假瘤3例、錯構瘤1例、曲菌球1例、支氣管擴張7例及肺炎1例。取手術切除的肺組織病變周圍的正常肺組織。（2）肺結核組：選取住院的單一肺結核患者45例，男29例，女16例，年齡（44±8）歲。（3）糖尿病合并肺結核組：選取同期住院的糖尿病合并肺結核患者15例，男12例，女3例，年齡（48±7）歲；均為2型糖尿病，病史1～10年。術前平均血糖（9.7±3.2）mmol/L，術后平均血糖（8.2±2.3）mmol/L，手術前后血糖無統計學差異（P>0.05）。3組年齡比較無統計學差異（P>0.05）。

1.1.3 診斷標準：肺結核診斷均由病理證實。2型糖尿病診斷標準按2010年ADA糖尿病診斷標準：（1）糖化血紅蛋白A1c≥6.5%或（2）血糖FPG≥7.0mmol/L。空腹定義為至少8h內無熱量攝入或（3）口服糖耐量試驗時2h血糖≥11.1mmol/L或（4）在伴有典型的高血糖或高血糖危象癥狀的患者，隨機血糖≥11.1mmol/L。而在無明確高血糖時，應通過重復檢測來證實標準（1）～（3）。

1.1.4 排除標準：合并免疫系統相關疾病，心、腎功能衰竭，支氣管結核，腫瘤；人免疫缺陷病毒陽性；近期應用免疫調節劑。

1.2 方法

1.2.1 標本采集：分別收集3組肺組織（1cm×1cm×1cm），用生理鹽水沖洗干凈，置10%甲醛液固定24h后，低溫石蠟包埋，制成石蠟切片。

1.2.2 測定方法：（1）標本處理：常規切片行HE染色復查診斷；（2）免疫組化方法：采用免疫組織化學染色SABC法，所有試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司，染色時一抗均為兔抗人的多克隆抗體，工作濃度均為1∶150，二抗為山羊抗兔IgG。按試劑盒提示進行操作。（3）結果判斷：顯微鏡下觀察各組中HE染色后的組織結構，觀察免疫組化反應的定位、分布及染色強度，每張切片陽性細胞的著色為棕黃色和棕褐色，并且陽性細胞數>5%認為陽性表達。每例均設有HE切片作對照觀察，并設陽性和陰性對照，用IPP6.0（image pro plus6.0）分析圖片，計算平均光密度（average optical density，AOD）值。

1.3 統計學分析

采用SPSS18.0統計軟件進行統計學分析，所有定量資料的描述，若正態分布，以±s表示。多組間均數比較采用方差分析或采用LSD檢驗方法進行兩兩比較。P<0.05判定為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TNF?α、IFN?γ及IL?10在各組的免疫組化染色結果

TNF?α、IFN?γ在對照組中以胞質及胞膜為主的較淡少量的棕黃色改變；肺結核組在上述部位的表達增多，在胞質及胞膜呈棕黃、褐黃色改變，明顯高于背景顏色，且分布不均勻、呈散在分布、局灶性表達；而在糖尿病合并肺結核組表達最弱。IL?10的表達以胞質及胞膜為主，在肺結核組表達最弱，糖尿病合并肺結核組較結核組增強。見圖1。

2.2 TNF?α、IFN?γ及IL?10的AOD計數結果

與對照組比較，，糖尿病合并肺結核組TNF?α AOD值明顯降低（P<0.01）；與肺結核組比較，TNF?α在糖尿病合并肺結核組也明顯降低（P<0.01）；與肺結核組比較，IFN?γ在糖尿病合并肺結核組AOD值降低（P<0.05）；與對照組比較，IL?10在肺結核組及糖尿病合并肺結核組的AOD值均降低（P<0.05）；與肺結核組比較，IL?10在糖尿病合并肺結核組的AOD值增高（P<0.05）。見表1。

3 討論

在宿主抗結核免疫中，TNF?α協同IFN?γ募集巨噬細胞及淋巴細胞到結核病灶，并與IL?3通過嗜中性粒細胞及巨噬細胞作用使炎性反應局部化而發揮抵抗結核桿菌感染作用。IL?10能增加精氨酸酶1的活性使氮中間體明顯減少，從總體上減弱巨噬細胞功能，并且能抑制保護性細胞因子TNF?α、IFN?γ的產生，使慢性結核分支桿菌感染者的肺組織內菌體大量復制［6，7］。而糖尿病在肺結核中是重要危險因素，目前已受到人們的廣泛關注。在Vallerskog等［8］對糖尿病大鼠的研究中發現，給予低劑量、低毒性的結核分枝桿菌氣溶膠感染大鼠后，其白細胞聚集延遲，結核分枝桿菌從肺組織到淋巴結的播散速度也延遲，認為這與IFN?γ在早期及中期較低水平相關，在糖尿病合并肺結核患者的血清中IFN?γ也明顯降低［2］。由此可見，在結核分枝桿菌感染的過程中，細胞因子對于機體的免疫應答是至關重要的，糖尿病患者的Th1/Th2型細胞因子失衡可能是導致對結核分枝桿菌易感及免疫應答延遲，不易清除結核分枝桿菌的主要原因。

圖1 細胞因子在肺組織中的表達情況 免疫組化×200Fig.1 Expression of cytokines in the lung tissue Histochemical staining×200

表1 3組肺組織中TNF?α、IFN?γ及IL?10的AOD計數表結果比較（n，±s）Tab.1 TNF?α，IFN?γ and IL?10AODcount results in lung tissues from three different groups（n，±s）

表1 3組肺組織中TNF?α、IFN?γ及IL?10的AOD計數表結果比較（n，±s）Tab.1 TNF?α，IFN?γ and IL?10AODcount results in lung tissues from three different groups（n，±s）

Compared with control group，1）P<0.05，2）P<0.01；compared with tuberculosis group，3）P<0.01，4）P<0.05.

Group n TNF?α IFN?γ IL?10Control group 13 0.224±0.064 0.242±0.015 0.185±0.049Tuberculosis group 45 0.283±0.075 0.292±0.067 0.115±0.0391）Tuberculosis with diabetes group 15 0.118±0.0502），3） 0.190±0.0684） 0.169±0.0571），4）

本研究發現，肺結核患者病灶中的TNF?α、IFN?γ的水平較對照組升高，但無統計學意義（P>0.05），可能是因為對照組的標本均來自炎性假瘤、支氣管擴張及曲球菌感染等炎性反應性疾病，所以參與炎性反應的重要細胞因子TNF?α、IFN?γ的水平也有所升高，從而使兩組間的差異性降低。其結果可以說明TNF?α、IFN?γ在維持和促進局部肺結核肉芽腫形成過程中的重要作用，與Bai等的研究結果一致［9］。TNF?α、IFN?γ的高表達，提示Th1型細胞免疫反應限制結核分枝桿菌的局部作用。而本研究中IL?10的水平在肺結核組較對照組降低，可以得出肺結核患者IL?10的缺失與低下將促進Th1型細胞相關因子的分泌及TNF?α的表達的推論，并且這一推論在Higgins等［10］對敲除小鼠IL?10基因的模型中得到同樣證實。本研究還發現，糖尿病合并肺結核患者病灶中TNF?α、IFN?γ的水平較單純肺結核組和對照組顯著降低，糖尿病合并肺結核患者體內的Th1型細胞免疫功能受損，免疫應答反應延遲，不利于機體對結核分枝桿菌清除；而糖尿病合并肺結核組IL?10較肺結核組升高，IL?10的高表達使結核分枝桿菌逃離宿主的免疫監視，使糖尿病患者的肺結核感染病程遷延，糖尿病這一因素在肺結核的局部免疫中起抑制性作用，其免疫功能低下的原因可能是TNF?α等先天性免疫細胞因子及IFN?γ等Th1型細胞因子減少，IL?10等Th2型細胞因子升高而導致局部細胞免疫功能減弱所致。而糖尿病患者的Th1/Th2型細胞因子失衡，可能是導致其易患肺結核的重要原因之一。

綜上所述，肺結核患者的結核病灶中TNF?α、IFN?γ的高表達對于促進肺結核局部炎性反應起著重要作用，而糖尿病合并肺結核患者的TNF?α、IFN?γ的低表達及IL?10的高表達，表明了糖尿病在肺結核發病過程中抑制細胞免疫功能，糖尿病患者Th1/Th2失衡將導致機體對結核分枝抗菌防御能力減弱。因此，進一步調控TNF?α、IFN?γ及IL?10表達，有可能成為提高糖尿病合并肺結核患者免疫功能（特別是局部的免疫功能）的一種新途徑。

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（編輯 武玉欣）

The Expression Levelsand Significance of Cytokinesin the Lung Lesions of Tuberculosis Patients with Diabetes Mellitus

ZHANGFang1，YANGFei2
（1.InstituteofRespiratoryDisease，TheFirstHospital，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，China；2.DepartmentofGeriatrics，ChestHospitalofShenyang，Shenyang110044，China）

ObjectiveTocomparecellularimmunefunctionandexploreitssignificanceinpatientswithtuberculosisortuberculosiscombinedwith diabetes.MethodsThe patients were divided into three groups：First group：13patients with benign lung lesions，Second group：45patients with tuberculosis，Third group：15patients with pulmonary tuberculosis and diabetes.Using immunocytochemistry SABCmethod，the expression of TNF?α and IFN?γ and IL?10in the lung lesions tissue were detected and compare the positive cells AODquantitative from every group.Variance analysis was performed after the rank transformation of AODvalues，then the LSDtest was employed for pairwise comparison.ResultsTNF?α，IFN?γ and IL?10is obvious expressed on the inflammatory reaction around the necrotic area.The TNF?α and IFN?γ AODvalues in the group of tuberculosis withdiabetesmellituswaslowerthanthegroupinthetuberculosisgroup（P<0.05）.TheTNF?α andIFN?γ AODvaluesinthegroupoftuberculosis group was higher than the control group（P>0.05）.The IL?10AODvalues in the group of tuberculosis with diabetes mellitus was higher than the group of tuberculosis（P<0.05）.The IL?10AODvalues in the group of tuberculosis was lower than the control group（P<0.05）.ConclusionOur results proved that the cytokines are involved in local immune response to tuberculosis such as TNF?alpha，IFN?gamma，IL?10.In addition，the diabetes patients are in local immune lower response.Regulating the cytokines in local tissue of diabetic patients could be a new method in immuno?therapy.

TNF?α；IFN?γ；IL?10；diabetes；tuberculosis

R521.9

A

0258-4646（2014）04-0313-03

http://www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20140429.1440.010.html

遼寧省科學技術計劃（2010225034）

張放（1965-），男，副教授，博士.E-mail：zhangfang001@yahoo.com

2014-01-28

網絡出版時間：2014-04-2914:39

·論著·