鐵皮石斛組培快繁關鍵技術研究

吳 菊，嚴中琪，楊 飛，殷武平

（浙江省舟山市農業科學研究院,浙江 舟山 316000）

鐵皮石斛組培快繁關鍵技術研究

吳 菊，嚴中琪，楊 飛，殷武平

（浙江省舟山市農業科學研究院,浙江 舟山 316000）

以鐵皮石斛種子和莖段為材料,研究鐵皮石斛快繁從原球莖誘導、增殖、分化,及壯苗生根的過程中不同時期的基本培養基及激素濃度和有機物等。結果表明,3/4MS為種子及莖段誘導、增殖、分化、壯苗生根階段較合適的基本培養基,且種子作為外植體誘導增殖效果較莖段好；原球莖誘導培養基3/4MS+1.0 mg· L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA,增殖激素濃度為1.0～2.0 mg·L-16-BA+0.1～0.2 mg·L-1NAA時效果最好,原球莖的分化激素配比為1.0 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA,壯苗和生根培養基為3/4MS+1.0 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA+10%馬鈴薯汁；有機添加物為10%的馬鈴薯汁,效果較好。

鐵皮石斛；組培；快繁

鐵皮石斛又名黑節草,是蘭科石斛屬多年生草本植物,為傳統名貴中藥,在 《神農本草經》中被列為上品,具有滋陰清熱、生津益胃、潤肺止咳、潤喉明目、延年益壽之功效,被稱為中華九大“救命仙草”之首。鐵皮石斛含有石斛堿、石斛次堿等生物堿及石斛寧和多糖等成分,具有抗腫瘤、抗衰老和擴張血管的作用［1-3］。然而,鐵皮石斛生長對環境要求苛刻,自然條件下萌發率極低,加上其具有極高的藥用與經濟價值,人們長期無節制的采挖,致使野生鐵皮石斛資源愈來愈稀少,種源已臨枯竭,被列為瀕危種。為實現鐵皮石斛資源的可持續利用,多年來國內外不少機構對鐵皮石斛人工栽培技術進行了研究,尤其是進入21世紀,我國研究人員在鐵皮石斛組培快繁技術方面的研究報道很多［4-8］。本研究在前人研究的基礎上,以鐵皮石斛為研究材料,系統地研究從外植體到原球莖誘導,增殖、分化及試管苗壯苗、生根過程的技術,為工廠化育苗提供技術支撐。

1 材料與方法

l.l 試驗材料

以野生鐵皮石斛種子和一年生鐵皮石斛莖段為試材。

l.2 試驗方法

1.2.1 無菌系建立

種子。取鐵皮石斛成熟蒴果保持新鮮,未開裂。采取人工授粉180 d以后,成熟,尚未開裂蒴果,用洗潔精溶液清洗蒴果表面,并在自來水下面沖洗30 m in。用刀片輕輕削去表面臟物,沖洗干凈后,在超凈工作臺上用75%的酒精消毒30 s,然后用無菌水沖洗3次,然后再將莖段放入0.1%的HgCl2溶液中滅菌12 m im,滅菌過程中不斷輕輕搖動燒杯使滅菌更加徹底,最后用無菌水沖洗5～6次,置于無菌濾紙上,表面水吸干后,用刀片從前端切去1段,使種子可以從前端孔處倒出,用鑷子夾住蒴果,將種子輕輕抖動播在誘導培養基上。

莖段。從生長旺盛的1年生鐵皮石斛植株上選擇生長健壯的莖段,摘去葉片和膜質葉鞘,以莖芽為中心,芽的上下各留1 cm,取長約2 cm的莖段,用洗潔精溶液浸泡20 m in,并在自來水下面沖洗30 min。在超凈工作臺上用75%的酒精消毒30 s,用無菌水沖洗3次,然后再將莖段放入0.1%的HgCl2溶液中滅菌10 mim,滅菌過程中不斷輕輕搖動燒杯使滅菌更加徹底,最后用無菌水沖洗5～6次,然后將莖段放在無菌濾紙上,將莖段的前后分別切去0.2 cm,切成長約0.5 cm左右的莖段,接種到誘導培養基上。

1.2.2 培養條件

在無菌室內進行培養,培養溫度 （25±1）℃,全光譜日光燈照射,光照強度為1 600～2 000 lx,光照時數12 h·d-1。

1.2.3 培養基的配制

根據不同試驗階段配置不同基本培養基,以MS或1/2MS作為基本培養基,然后根據不同培養目的添加不同濃度的激素,糖和有機添加物等,培養基pH值5.8。加7.5 g·L-1的瓊脂粉。滅菌條件是121℃,0.105 MPa,滅菌時間為30 min。

l.3 研究內容

1.3.1 鐵皮石斛原球莖的誘導和增殖研究

外植體誘導培養基篩選。采用 1/2MS,3/ 4MS,MS,B5,N6等5種基本培養基,附加1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA進行不同培養基對鐵皮石斛原球莖和擬原球莖誘導和增殖試驗。

原球莖 （擬原球莖）誘導和增殖激素的篩選。將鐵皮石斛種子和莖段各自分別接種于含不同濃度的生長素2,4-D,NAA,IBA和不同濃度的細胞分裂素6-BA和KT進行生長素和細胞分裂素交互作用對原球莖 （擬原球莖）誘導和增殖試驗。

原球莖增殖激素配比試驗方法。選取相同條件下生長良好的原球莖,約1.5 cm直徑的團塊,分別接種到9種不同培養基,每種接種5瓶,每瓶接種3個原球莖團,35 d后統計結果。

天然有機附加物對原球莖 （擬原球莖）增殖影響研究。在3/4MS基本培養基中加1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA條件下,分別添加20%的椰乳、馬鈴薯汁、香蕉泥、番茄汁,考察原球莖的增殖率和苗的健壯程度。

1.3.2 鐵皮石斛原球莖分化培養基激素的篩選

以3/4MS為基本培養基,取相同條件下生長良好的原球莖,切成1.5 cm直徑的團塊,分別接種到附加NAA,6-BA和KT等培養基上進行激素配比篩選試驗,每種培養基接種10瓶,每瓶接種3個原球莖團,45 d后統計結果。

1.3.3 鐵皮石斛試管苗壯苗和生根研究

以3/4MS為培養基,研究不同添加物及不同激素配比對鐵皮石斛試管苗壯苗和生根的影響。取株高為1～2 cm,具有1～2片真葉的無根叢生苗,分別接種到不同培養基中。每種培養基接10瓶,每瓶接6株小苗,分別于45 d和60 d后統計結果。

2 結果和分析

2.l 鐵皮石斛原球莖的誘導和增殖

2.1.1 不同外植體誘導培養基篩選

采用1/2MS,3/4MS,MS,B5,N6等5種基本培養基,附加1.0 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA進行不同培養基對鐵皮石斛不同外植體的原球莖 （擬原球莖）誘導和增殖試驗。

由表1可以看出,種子在這5種培養基上誘導率均較高,且種子比莖段的誘導率高,而誘導時間不同,培養基差異不明顯。相比而言,MS培養基上種子的誘導率較高,其中3/4MS培養基上誘導率最高,為85%,可見種子萌發及發育需要鹽分較高的培養基,但過高的鹽分也會使種子萌發率下降,原球莖顏色偏黃。在不同培養基上,種子誘導的原球莖均為魚籽狀,較小,量大,顏色為淡綠色或綠色；莖段產生的愈傷較小,有擬原球莖產生,但量比較少。B5和N6培養基誘導率較高,誘導率達60%～70%,原球莖或擬原球莖顏色為淡綠或黃綠色。總體看來,3/4MS培養基效果最好,以種子作為外植體的原球莖產生的數量大,快繁速度優于莖段。

表1 不同外植體誘導培養基對原球莖 （擬原球莖）誘導情況

由表2,3可以看出,這5種基本培養基以3/ 4MS培養基增殖系數最高,為10.5,且健壯程度最高；其次是B5和N6,且健壯程度較高；種子平均增殖系數為8.5,顯著高于莖段的3.7,種子的年增殖率為8.36×109顯著高于莖段的6.58×106,種子的原球莖增殖速度顯著高于莖段,且原球莖綠色,較小,節間短。

2.1.2 擬原球莖誘導激素的篩選

將莖段分別接種于以3/4MS為基本培養基,含不同濃度的生長素2,4-D,NAA,IBA和不同濃度的細胞分裂素6-BA進行生長素和細胞分裂素交互作用對擬原球莖誘導和增殖試驗。

表2 不同培養基、外植體對原球莖增殖情況

表3 種子及莖段外植體原球莖平均增殖情況比較

由試驗結果表4可知,不同處理對擬原球莖的誘導影響有顯著差異,6-BA+NAA激素組合的平均擬原球莖誘導率51.94%,高于其他激素組合,同時誘導時間為20.25 d,總體比較短,處理2組合的擬原球莖誘導率最高,為60.00%,但NAA濃度過高,原球莖較松散且有玻璃化現象,所以擬原球莖的誘導培養基為1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg· L-1NAA,誘導率達60.00%,誘導時間最短,僅為17 d。

2.1.3 原球莖增殖激素的篩選

在鐵皮石斛組織培養過程中,原球莖增殖是關鍵環節,原球莖增殖是用最短的時間獲得大量組培苗的有效方法,其中影響原球莖增殖系數的一個關鍵因素是培養基中激素濃度的配比。為研究激素配比對石斛原球莖增殖的影響,以3/4MS為基本培養基,添加6-BA和NAA等激素進行配比試驗,表5表明,6-BA和NAA配合使用有利于原球莖的增殖,原球莖生長狀況良好,原球莖簇生,較為松散、淡綠色；且處理1～6的原球莖生長還比較健壯,顏色為綠色或淡綠色,原球莖為致密或較松散,增殖系數隨處理濃度的提高而增加；隨著6-BA和NAA濃度的提高,即處理7～9增殖系數最高,為6.17～9.13,但玻璃化現象越來越嚴重,原球莖為黃綠色,甚至透明,更松散。這表明：較高濃度的6-BA配合較低濃度的NAA,有利于原球莖的增殖,但濃度過高會引起玻璃化現象,原球莖不健康,造成畸形,根據本試驗結果：較為理想的原球莖增殖激素濃度為1.0～2.0 mg·L-16-BA+0.1～0.2 mg· L-1NAA。

表4 擬原球莖誘導激素種類的篩選

表5 6-BA與NAA濃度對原球莖增殖的影響

2.1.4 天然有機附加物對原球莖增殖影響研究

在3/4MS基本培養基加1.0 mg·L-16-BA+ 0.1 mg·L-1NAA條件下,分別添加20%的椰乳、馬鈴薯汁、香蕉泥、番茄汁,考查原球莖的增殖率和苗的健壯程度。

由表6可見,4種天然有機添加物對鐵皮石斛苗增殖的影響不同,椰子汁與馬鈴薯汁效果最好,且兩者差異不顯著,組培苗均較粗壯,葉色濃綠。香蕉泥增殖效果次之,苗長勢一般,葉色稍淺,但與前兩者差異極顯著,番茄汁增殖效果最差,且組培苗細弱發黃。

表6 天然有機添加物對幼苗增殖率的影響

2.2 鐵皮石斛分化培養基激素的篩選

為研究不同激素配比對鐵皮石斛原球莖分化的影響,以3/4MS為基本培養基,附加NAA,6-BA和KT等進行激素配比試驗。培養45 d后統計原球莖分化的情況,結果如表7所示。 （1）添加一定濃度的NAA,6-BA,KT,可以增加分化芽數。處理①不使用激素的分化芽數最少,為30個；處理④,⑤,⑧之間差異不顯著,分化芽數較多,為60個左右,其中,處理⑧的效果最好,分化芽數為65個。處理④,⑤,⑧與處理⑥,⑦間差異顯著,而處理⑥,⑦與處理①,②,③間差異顯著,這表明1.0～2.0 mg·L-1NAA與0.1～0.2 mg· L-16-BA對原球莖的分化有較好的促進作用,且苗的健壯度和整齊度較好,1.0 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1KT的激素組合,原球莖的分化率最高,健壯度較好,但整齊度一般,原球莖增殖較多。據此建議原球莖的分化激素配比為1.0 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA,分化率較高,健壯度、整齊度最好。

2.3 鐵皮石斛壯苗及生根

為研究不同添加物對石斛試管苗壯苗和生根的影響,以3/4MS為基本培養基,附加NAA,6-BA, IBA和有機物馬鈴薯汁,培養45 d后統計壯苗和生根情況 （表8）。（1）培養基中不添加任何植物生長調節劑和馬鈴薯汁,植株長勢差,葉色淡綠,健壯度低。（2）在培養基中加入較高濃度的NAA（1～2 mg·L-1）和較低濃度的6-BA（0.1～0.2 mg·L-1）,以及馬鈴薯汁,試管苗的葉色更綠,長勢更強,健壯程度也會提高。在苗的生長勢均較強的情況下,盡量降低植物生長素的使用濃度,以利于提高組培苗移栽成活率,所以建議壯苗培養基為1.0 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA+10%馬鈴薯汁。

表7 不同激素對原球莖分化的影響

表8 不同激素及添加物對試管苗壯苗的影響

當分化后的小苗長成1～2 cm高,并分化出1～2片葉片時,將小苗接種在小苗生根培養基上,接種60 d后記錄生根情況。無根小苗在接種20 d后開始出現根的分化,在莖基部或節上出現淺黃綠色突起,尖端顏色較淺,長度約1 mm。接種60 d后各處理的生根率在10%～65%。平均根長在2.43～4.10 cm,平均根數在5～12條,根為淺綠色,根表面光滑,一些小苗長出氣生根,氣生根特點是其表面有白色茸毛組成的根被。表9研究了不同濃度的NAA,6-BA,IBA及馬鈴薯汁對試管苗生根的影響 （表9）,當不用任何激素和有機添加物時,60 d后生根率最低,僅為20%,平均根數也最少為5條,平均根長最短為2.43 cm,生長勢也較弱,使用一定濃度的生長素NAA,配合一定濃度的6-BA,和添加10%的馬鈴薯汁對生根誘導有明顯的促進作用,其中處理④和⑤組合的生根率相對較高,分別為60%和65%,平均根數和根長及生長勢綜合表現最好。建議生根植物生長調節劑為1.0～2.0 mg·L-1NAA+0.1～0.2 mg·L-16-BA,并添加10% 的馬鈴薯汁。

表9 不同激素配比及添加物對試管苗生根的影響

3 小結

采用1/2MS,3/4MS,MS,B5,N6等5種基本培養基,附加1.0 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA進行不同培養基對鐵皮石斛不同外植體的原球莖 （擬原球莖）誘導和增殖的影響,發現3/ 4MS為種子及莖段誘導最合適的基本培養基,且種子作為外植體,原球莖產生的數量大,從快繁速度上優于莖段,種子誘導原球莖增殖速度顯著高于莖段,即種子做為外植體誘導增殖效果較莖段好。

莖段在3/4MS的基本培養基,在不同濃度的生長素2,4-D,NAA,IBA和不同濃度的細胞分裂素6-BA進行生長素和細胞分裂素交互作用對擬原球莖誘導和增殖試驗得出,莖段的誘導培養基1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA組合下,誘導率最高可達60.00%,誘導時間最短,僅為17 d。原球莖增殖激素濃度為1.0～2.0 mg·L-16-BA +0.1～0.2 mg·L-1NAA時效果最好。

在3/4MS基本培養基加1.0 mg·L-16-BA+ 0.1 mg·L-1NAA條件下,分別添加20%的椰乳、馬鈴薯汁、香蕉泥、番茄汁,考查天然有機附加物對原球莖 （擬原球莖）增殖影響結果表明,椰子汁與馬鈴薯汁效果最好,且兩者差異不顯著,組培苗均較粗壯,葉色濃綠。有機物因地制宜采用本地資源馬鈴薯較為適宜,效果較好。

以3/4MS為基本培養基,附加NAA,6-BA和KT等進行激素配比試驗研究不同激素配比對鐵皮石斛原球莖分化的影響,結果表明,原球莖的分化激素配比為1.0 NAA+0.1 mg·L-16-BA,分化率較高,健壯度、整齊度最好。

以3/4MS為基本培養基,附加NAA,6-BA, IBA和有機物馬鈴薯汁研究不同添加物對石斛試管苗壯苗和生根的影響得出,壯苗培養基為1.0 mg· L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA+10%馬鈴薯汁。生根培養基為1.0～2.0 mg·L-1NAA+0.1～0.2mg· L-16-BA,并添加10%馬鈴薯汁。

4 討論

4.l 不同外植體研究

可用于鐵皮石斛離體快繁的外植體有莖尖、莖節、葉片、花梗、側芽、腋芽和種子等類型,據調查,現在生產應用最多是種子和莖段的快繁,由種子離體培養產生的胚性組織稱為原球莖,莖尖、莖段等誘導形成的胚性組織稱為擬原球莖。

種子作為外植體相比莖段,原球莖產生的數量多大,從快繁速度上優于莖段,種子的年增殖率為8.36×109,顯著高于莖段的6.58×106；種子誘導原球莖增殖速度顯著高于莖段,即種子作為外植體誘導增殖效果較莖段好。且種子誘導萌發后,約40 d左右轉接1次,基本培養基選擇3/4MS,用較低濃度的植物生長素,原球莖增殖激素濃度為1.0～2.0 mg·L-16-BA+0.1～0.2 mg·L-1NAA,原球莖的分化激素配比為1.0 mg·L-1NAA +0.1 mg·L-16-BA；壯苗培養基為1.0 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA+10%馬鈴薯汁。生根培養基為1.0～2.0 mg·L-1NAA+0.1～0.2 mg·L-16-BA,并添加10%馬鈴薯汁。只要及時轉接,原球莖和幼苗生長健壯,成苗周期相對較短,基本上從播種到瓶苗移出,可以控制在8個月左右,且苗的移栽成活率在95%以上。

4.2 基本培養基對鐵皮石斛快繁的影響

在組織培養中,各種營養元素主要從培養基中獲得,氧、氫元素從水中得到。礦物元素主要靠加入適量的無機鹽類提供。常用的氮素有硝態氮和氨態氮,大多數培養基都以硝態氮為主。植物組織從培養基中吸收硝態氮以后,經過一系列的反應轉化成氨基酸,進一步合成蛋白質。不同配方所采用的鹽類及其數量有所差異,甚至出入很大,常根據培養基中含鹽量的不同將培養基分為4大類［8］：第1類富集元素平衡培養基即高鹽培養基,如 MS, LS,BL,ER等；第2類為高硝酸鉀類培養基,如B5,N6等；第3類中無機鹽含量的培養基,如H, Nitch；第4類為低無機鹽培養基如White,WS, HE。目前使用最廣泛的培養基為MS,其特點是高含量的氮、鉀,尤其是硝酸鹽的用量大,且含有一定數量的銨鹽,因此營養豐富,能支持培養材料快速生長。

本試驗采用1/2MS,3/4MS,MS,B5,N6等5種基本培養基,附加1.0 mg·L-1NAA+0.5 mg· L-16-BA進行不同培養基對鐵皮石斛不同外植體的原球莖 （擬原球莖）誘導和增殖的影響,發現3/4MS為種子及莖段誘導最合適的基本培養基,1/ 2MS培養基鹽分較低,原球莖顏色為淡綠色,3/ 4MS和MS培養基上誘導率較高,其中3/4MS培養基上誘導率最高,為85%,可見種子萌發及發育需要鹽分較高的培養基,但過高的鹽分也會使種子萌發率稍微下降,原球莖顏色偏黃。

在原球莖增殖分化階段用3/4MS基本培養基,配合適當濃度的激素,效果較好,原球莖簇生、健壯、致密、綠色；壯苗生根階段用3/4MS培養基,配合1.0 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA+10%馬鈴薯汁,苗的健壯度最好。

4.3 生長調節劑與原球莖誘導增殖和分化成苗

在培養基的各種成分中,植物激素的作用是獨特的。一般來說,大多數植物在任何一種基本培養基上的生長狀況是相似的,基本培養基可保證植物材料的生存與最低的生理活動。但是若要植物進行細胞分裂、愈傷組織的誘導、分化和再生,根、芽的分化以及胚狀體的發育等一系列生理活動,則必須用植物激素來調節。本試驗在不同濃度的2,4-D,NAA,IBA和不同濃度的6-BA進行生長素和細胞分裂素交互作用對擬原球莖誘導和增殖試驗得出：莖段的誘導培養基1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg· L-1NAA組合下,誘導率最高可達60.00%,誘導時間最短,僅為17 d。原球莖增殖激素濃度為1.0～2.0 mg·L-16-BA+0.1～0.2 mg·L-1NAA時效果最好。

本試驗在原球莖分化與幼苗生長階段,使用較高濃度的生長素,配合較低濃度的細胞分裂素,即壯苗階段培養基為1.0 mg·L-1NAA+ 0.1 mg·L-16-BA+10%馬鈴薯汁。生根培養基為1.0～2.0 mg·L-1NAA+0.1～0.2 mg·L-16-BA,并添加10%馬鈴薯汁,鐵皮石斛苗長勢最好,生根速度較快,這一結論說明了較高濃度的NAA與較低濃度的6-BA的配合有利于幼苗生長和生根,且效果較好。單獨使用NAA或2,4-D,對幼苗生長效果并不好,說明同一類激素不同種類間的效應差異和植物物種或品種對激素反應的特異性,反映了激素作用的復雜性,因此植物組培的不同階段激素配比試驗是組培能否成功的關鍵。

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（責任編輯：張瑞麟）

S 567

：A

：0528-9017（2014）04-0492-06

文獻著錄格式：吳菊,嚴中琪,楊飛,等.鐵皮石斛組培快繁關鍵技術研究 ［J］.浙江農業科學,2014（4）：492-497.

2013-12-09

舟山市科技計劃項目 （10123）

吳 菊 （1979-）,江蘇睢寧人,農藝師,本科,從事植株組培快繁、蔬菜無土栽培技術研究工作。E-mail：wuju-79-2000 @tom.com。