蘋果多酚對卡介苗聯合脂多糖所致小鼠免疫性肝損傷的保護作用

王 芳薛 楊楊靜玉王 歡吳春福

（1沈陽藥科大學神經藥理系，沈陽，110016；2遼寧省植物多酚研究與開發工程技術研究中心，沈陽，110016）

實驗研究

蘋果多酚對卡介苗聯合脂多糖所致小鼠免疫性肝損傷的保護作用

王 芳1，2薛 楊1，2楊靜玉1，2王 歡1，2吳春福1，2

（1沈陽藥科大學神經藥理系，沈陽，110016；2遼寧省植物多酚研究與開發工程技術研究中心，沈陽，110016）

目的：觀察蘋果多酚（Apple Polyphenols，AP）對小鼠免疫性肝損傷的保護作用。方法：采用卡介苗聯合脂多糖制備小鼠免疫性肝損傷模型。研究AP對小鼠肝指數和脾指數，血清中谷草轉氨酶（Aspartate Transaminase，AST）和谷丙轉氨酶（Alanine Transaminase，ALT）活性，血清總蛋白（Total Protein，TP），白蛋白（Albumin，Alb）和白蛋白/球蛋白（A/G）含量的改善作用，同時采用HE染色方法觀察AP對免疫性肝損傷小鼠肝臟病理改變的保護作用。結果：AP能明顯抑制免疫性肝損傷模型小鼠異常升高的肝指數和脾指數，降低血清中AST活性，不同程度地升高血清中TP和Alb的含量，同時對肝組織病理異常變化也有顯著的改善作用。結論：AP對卡介苗聯合脂多糖所致的小鼠免疫性肝損傷具有保護作用。

蘋果多酚；卡介苗；脂多糖；免疫性肝損傷

肝臟是機體排解毒物和代謝的重要器官，易受多種病原體、毒物及免疫紊亂所累及，引發肝臟疾病，影響人體正常的生理功能。病毒性肝炎、自身免疫性肝病等是困擾人類已久的肝臟疾病，多數易由急轉慢，長期可發展至肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌等，因此在這類疾病的早期防治方面，阻止慢性發展過程、保護肝功能就顯得十分關鍵和重要。雖然這類疾病誘發因素各有不同，但是目前公認異常免疫應答是這類肝病發病的重要機制之一［1-2］。因此，利用免疫反應誘導的肝損傷動物實驗模型，從天然產物中尋求能顯著減輕肝損傷，提高肝功能且安全性高的活性成分就具有重要的現實意義。

蘋果多酚（Apple polyphenols，AP）是蘋果中具有重要生物活性的一類天然多酚類物質，具有強抗氧化、清除自由基作用［3-4］，在抗癌［5-6］、抗過敏［7-8］、抑菌［9］、抗炎［10］和減肥降脂［11］等方面都表現出良好的活性。因AP具有眾多活性功能和潛在的開發應用前景，其研究越來越受到人們的關注。我們前期研究已經發現AP能通過清除自由基、提高機體抗氧化能力對CCl4等所致化學性肝損傷具有顯著的改善作用［12］。我們利用卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin vaccine，BCG）聯合脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）方法誘導建立小鼠免疫性肝損傷模型，來研究AP對免疫性肝損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 藥品 AP由天津尖峰天然產物研究開發有限公司提供。含有多酚類物質81.29%，其中綠原酸17.08%，原花青素7.31%，根皮苷5.17%。實驗時用蒸餾水配制成所需濃度。聯苯雙酯滴丸（Bifondate Pills，BP），浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠，批號090701。BCG，中國生物制品檢定檢驗所，批號：2008 -7。LPS，Sigma公司，批號103H0524。

1.2 動物 昆明種小鼠（雄性）SPF級，體質量（20± 2）g，沈陽藥科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK2007-004。適應性飼養2～3 d后進行實驗。

1.3 儀器 美國BH13MD1600型全自動生化分析儀。瑞士L104-IC型電子天平。

1.4 動物分組、模型建立及給藥 小鼠隨機分為6組：溶媒對照組，模型組，陽性藥聯苯雙酯滴丸（BP）組，AP 200、400和800 mg/kg劑量組。采用BCG結合LPS制備免疫性肝損傷模型。實驗第1 d，除溶媒對照組尾靜脈注射等容量生理鹽水外，各組小鼠經尾靜脈注射BCG 2.5 mg/0.2 mL/只。溶媒對照組和模型組灌胃蒸餾水，陽性藥組灌胃BP 200 mg/kg，AP組灌胃AP 200、400或800 mg/kg，連續給藥12 d。末次給藥后除溶媒對照組尾靜脈注射等容量生理鹽水外，其他各組小鼠尾靜脈注射脂多糖LPS 7.5 μg/0.2 m L/只。

1.5 血清AST，ALT，TP和Alb檢測 LPS注射10 h后眶靜脈叢取血，3 500 r/min離心10 min，分離血清。全自動生化分析儀測定AST、ALT、TP和Alb水平，并計算A/G值。計算方法如下。

1.6 肝指數和脾指數計算 實驗末日動物稱重，將動物處死，取肝和脾稱重，計算肝指數和脾指數。計算方法如下。

1.7 肝臟病理學檢查 取肝右小葉置于10%甲醛中，固定，HE染色，進行組織病理學檢查，病理變化分級評價判斷標準如下［13］：根據肝組織炎癥、壞死程度，將肝組織病理改變分五級（0-Ⅳ）；“0”肝細胞形態結構正常，無損害，無壞死；“Ⅰ”有輕微變性水腫，散在炎細胞，點狀壞死；“Ⅱ”肝細胞壞死呈灶狀或片狀，占肝小葉1/3以內，炎癥細胞浸潤呈灶狀；“Ⅲ”肝細胞壞死呈廣泛壞死，占小葉1/3～1/2，炎癥浸潤呈片狀；“Ⅳ”肝細胞壞死占小葉1/2以上，重度炎性細胞浸潤，呈片狀。

1.8 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，實驗數據用（±s）表示，采用One-Way ANOVA單因素方差分析評價整體性差異，方差齊性用LSD方法進行組間比較，方差不齊用Dunnett's T3分析方法進行組間比較。病理學評分采用秩和檢驗進行比較。

2 結果

2.1 AP對免疫性肝損傷小鼠肝指數和脾指數的影響

與對照組相比，BCG聯合LPS所致的免疫性肝損傷小鼠出現肝指數和脾指數顯著升高（P＜0.01）。給藥12 d后，AP 200、400和800 mg/kg均可顯著抑制BCG和LPS引起的肝、脾指數的升高（P＜0.05，P＜0.01）。陽性藥BP 200mg/kg同樣能顯著抑制BCG和LPS引起的肝、脾指數的升高（P＜0.05，P＜0.01）。結果見表1。

表1 AP對免疫性肝損傷小鼠肝指數和脾指數的影響（±s）

表1 AP對免疫性肝損傷小鼠肝指數和脾指數的影響（±s）

注：與溶媒對照組比，**P＜0.01；與模型組比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分組劑量例數肝指數（%）脾指數（%）12 4.82±0.10 0.59±0.03 BCG+LPS 2.5 mg+7.5μg/只8 5.61±0.18**0.73±0.05**AP 200 mg/kg 10 5.11±0.14△0.62±0.01△400 mg/kg 8 5.17±0.15△0.63±0.02△800mg/kg 9 5.11±0.14△0.61±0.03△△BP 200 mg/kg 8 4.89±0.08△△0.58±0.03溶媒對照——△

2.2 AP對免疫性肝損傷小鼠血清AST和ALT的影響 BCG聯合LPS所致的免疫性肝損傷小鼠血清中AST和ALT活性顯著升高（P＜0.01），AP 800 mg/kg給藥12 d后顯著降低BCG聯合LPS所致的免疫性肝損傷小鼠血清中升高的AST活性（P＜0.05）。陽性藥BP 200 mg/kg也能使血清中異常升高的AST和ALT活性顯著降低（P＜0.01，P＜0.01）。結果見表2。

表2 AP對免疫性肝損傷小鼠血清ALT和AST活性的影響（±s）

表2 AP對免疫性肝損傷小鼠血清ALT和AST活性的影響（±s）

注：與溶媒對照組比，**P＜0.01；與模型組比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分組劑量例數AST（U/L）ALT（U/L）溶媒對照組——12 114.77±2.93 39.54±3.53 BCG+LPS 2.5mg+7.5μg/只12 822.83±44.87**375.00±21.76**AP 200mg/kg 10 639.50±40.53 308.89±86.96 400 mg/kg 12 645.90±34.71 321.670±93.91 800 mg/kg 11 545.36±57.54△360.38±72.47 BP 200 mg/kg 8 523.00±37.54△△160.62±13.11△△

2.3 AP對免疫性肝損傷小鼠血清TP、Alb和A/G比值的影響 與空白組相比，BCG聯合LPS所致的肝損傷可以顯著降低小鼠血清TP、Alb含量及A/G比值（P＜0.01），AP 200、400 mg/kg可顯著升高血清中TP含量（P＜0.05），AP 400 mg/kg可顯著升高血清中Alb含量（P＜0.01）。結果見表3。

表3 AP對免疫性肝損傷小鼠血清TP、Alb和A/G活性的影響（±s）

表3 AP對免疫性肝損傷小鼠血清TP、Alb和A/G活性的影響（±s）

注：與溶媒對照組比，**P＜0.01；與模型組比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

A/G溶媒對照組——分組劑量例數TP（g/L）Alb（g/L）12 63.22±0.83 40.62±0.73 1.84±0.07 BCG+LPS 2.5 mg+7.5μg/只12 50.60±1.11**30.65±0.46**1.56±0.05**AP 200mg/kg 10 54.19±1.38△32.73±1.33 1.53±0.06 400mg/kg 12 54.85±1.38△33.91±0.87△△1.63±0.04 800 mg/kg 11 51.16±0.77 32.04±0.67 1.66±0.08 BP 200 mg/kg 8 52.08±1.66 32.15±1.26 1.61±0.04

2.4 病理組織學觀察 溶媒對照組病理切片光鏡下觀察可見肝小葉結構正常，肝細胞胞漿飽滿（圖1A），等級評價為0級（表4）。BCG聯合LPS誘導肝損傷模型組可見肝小葉圖像紊亂，結構不清楚，肝細胞嗜酸性變性，炎性細胞浸潤嚴重，并伴有大面積點狀或片狀壞死（圖1B），等級評價顯示模型組損傷程度顯著高于溶媒對照組（P＜0.01）（表4）。AP 200、400 mg/kg組可見肝組織出現不同程度凝固性壞死，炎性細胞浸潤（圖1C和圖1D），等級評價與模型組相比無統計學意義（表4）。AP 800 mg/kg組肝小葉結構較清晰，炎性細胞浸潤減少，肝細胞壞死面積減少，病變程度明顯改善（圖1E），等級評價較模型組有顯著降低（P＜0.05）（表4）。BP 200mg/kg肝組織亦可見不同程度凝固性壞死，炎性細胞浸潤（圖1F）。

圖1 各組小鼠代表性的肝臟HE染色圖片（×400）

表4 AP對免疫性肝損傷小鼠肝組織病理評分的影響

3 討論

病毒性肝炎、自身免疫性肝炎等肝臟疾病嚴重威脅人類健康。雖然誘發病因各不相同，但研究顯示活化的淋巴細胞所引起的機體異常免疫反應與病毒性肝炎和自身免疫性肝病的病理過程相關，機體免疫應答異常已被公認為是這類疾病發病過程的重要機制之一［1-2］。以免疫機制誘發的免疫性肝損傷動物實驗模型，因能刺激T淋巴細胞活化，激活肝內免疫反應，最終導致肝細胞損傷、壞死，可以很好的模擬肝炎病癥的免疫病理過程，對病毒性肝炎和自身免疫性肝病的研究具有重要意義［14］。

BCG和LPS聯合作用誘導的小鼠免疫性肝損傷模型是常用的研究病毒性肝炎及保肝藥物的經典動物模型［15-16］。BCG是一種減毒的活性結核桿菌疫苗，具有抗原性，但不含內毒素，毒性極弱，LPS為革蘭氏陰性菌細胞壁主要成分，BCG處理后的動物對LPS十分敏感，能引發以凋亡為特點的肝細胞損傷。BCG進入體內能使T淋巴細胞致敏，激活肝中巨噬細胞-Kupffer細胞，引起Kupffer細胞的聚集和肝內浸潤，此時給予低劑量LPS攻擊，可激發這些致敏的細胞向肝中釋放對肝細胞有毒性作用的細胞因子TNF-α、白介素等，從而激活凋亡通路、誘導氧化應激等一系列生物效應，最終導致肝損傷［17］。本文采用尾靜脈注射BCG刺激12 d后LPS誘導攻擊的方式制備小鼠免疫性肝損傷模型。小鼠出現肝脾指數、血清中AST和ALT活性顯著增加升高，血清TP、Alb含量及A/G比值顯著降低，肝細胞中度或重度炎性細胞浸潤，存在點狀、灶性壞死等現象，說明在我們的實驗條件下成功制備了小鼠免疫性肝損傷模型。

使用此模型發現AP能顯著抑制肝脾指數的升高，不同程度地減少肝功能的異常，表現為降低血清中AST活性，同時升高血清中TP和Alb的含量。對肝組織病理變化也有改善作用。本研究首次發現AP具有改善免疫性肝損傷的作用。AP是蘋果中多元酚類物質的總稱，主要成分包括黃酮類化合物（兒茶素、表兒茶素、根皮苷、原花青素和槲皮素等），酚酸及羥基酚酸酯（主要為綠原酸和咖啡酸）和糖類衍生物等［18］。由于AP的眾多活性都與其強大的清除自由基和抗氧化作用相關［19-20］，推測AP改善免疫性肝損傷的作用也可能與其清除自由基和抗氧化作用相關。具體的機制值得深入研究。

對于病毒性肝炎和自身免疫性肝病，阻止發病過程中病程惡化，提高和改善肝功能極為重要，現有的抗病毒藥物或免疫抑制劑雖可從致病原因上遏制疾病發展，但在改善肝臟病理狀態，維持肝細胞結構，提高肝臟功能等方面并不具有優勢，加之不同程度的不良反應，限制了使用人群。AP是從蘋果皮渣中提取的天然產物，安全性高。本研究拓寬了AP保肝作用的應用范圍，顯示出了其良好的應用前景。

［1］Herkel J，Schuchmann M，Tiegs G，et al.Immune-mediated liver injury［J］.JHepatol，2005，42（6）：920-923.

［2］Della Corte C，SartorelliMR，Comparcola D，etal.Autoimmune liver diseases［J］.Minerva Pediatr，2012，64（6）：595-606.

［3］Denis MC，Furtos A，Dudonne S，et al.Apple peel polyphenols and their beneficial actions on oxidative stress and inflammation［J］.PLoSOne，2013，8（1）：e53725.

［4］Bai X，Zhang H，Ren S.Antioxidant activity and HPLC analysis of polyphenol-enriched extracts from industrial apple pomace［J］.JSci Food Agric，2013，93（10）：2502-2506.

［5］Miura D，Miura Y，Yagasaki K.Effect of apple polyphenol extract on hepatoma proliferation and invasion in culture and on tumor growth，metastasis，and abnormal lipoprotein profiles in hepatoma-bearing rats［J］. Biosci Biotechnol Biochem，2007，71（11）：2743-2750.

［6］Zheng CQ，Qiao B，Wang M，et al.Mechanisms of apple polyphenolsinduced proliferation inhibiting and apoptosis in ametastatic oral adenoid cystic carcinoma cell line［J］.Kaohsiung JMed Sci，2013，29（5）：239-245.

［7］Kojima T，Akiyama H，SasaiM，etal.Anti-allergic effect of apple polyphenol on patients with atopic dermatitis：A pilot study［J］.Allergol Int，2000，49（1）：69-73.

［8］Zuercher AW，Holvoet S，WeissM，etal.Polyphenol-enriched appleextract attenuates food allergy inmice［J］.Clin Exp Allergy，2010，40（6）：942-950.

［9］Choi O，Yahiro K，Morinaga N，et al.Inhibitory effects of various plant polyphenols on the toxicity of Staphylococcal alpha-toxin［J］.Microb Pathog，2007，42（5-6）：215-224.

［10］Femia AP，Luceri C，Bianchini F，et al.Marie Menard app les with high polyphenol content and a low-fat diet reduce 1，2-dimethylhydrazine -induced colon carcinogenesis in rats：effects on inflammation and apoptosis［J］.Mol Nutr Food Res，2012，56（8）：1353-1357.

［11］Boque N，de la Iglesia R，de la Garza AL，et al.Prevention of diet-induced obesity by apple polyphenols in Wistar rats through regulation of adipocyte gene expression and DNA methylation patterns［J］.Mol Nutr Food Res，2013，57（8）：1473-1478.

［12］Yang J，Li Y，Wang F，et al.Hepatoprotective effects of apple polyphenols on CCl4-induced acute liver damage in mice［J］.JAgric Food Chem，2010，58（10）：6525-6531.

［13］楊舒淳.旋覆花苦豆子合劑應用于急性免疫性肝損傷的實驗研究［D］.烏魯木齊：新疆醫科大學，2008.

［14］Dienes HP，Drebber U.Pathology of immune-mediated liver injury［J］.Dig Dis，2010，28（1）：57-62.

［15］Zhang NN，Huang NY，Zhou XK，et al.Protective effects of IL-4 on Bacillus Calmette-Guerin and lipopolysaccharide induced immunological liver injury in mice［J］.Inflamm Res，2012，61（1）：17-26.

［16］Jiang C，Jiao Y，Chen X，etal.Preliminary characterization and potential hepatoprotective effect of polysaccharides from Cipangopaludina chinensis［J］.Food Chem Toxicol，2013，59：18-25.

［17］Wang H，WeiW，Shen YX，et al.Protective effect ofmelatonin against liver injury in mice induced by Bacillus Calmette-Guerin plus lipopolysaccharide［J］.World JGastroenterol，2004，10（18）：2690-2696.

［18］Lotito SB，Frei B.Relevance of apple polyphenols as antioxidants in human plasma：contrasting in vitro and in vivo effects［J］.Free Radic Biol Med，2004，36（2）：201-211.

［19］Vineetha VP1，Girija S，Soumya RS，et al.Polyphenol-rich apple（Malus domestica L.）peel extract attenuates arsenic trioxide induced cardiotoxicity in H9c2 cells via its antioxidant activity［J］.Food Funct，2014，5（3）：502-511.

［20］Yue T，Shao D，Yuan Y，et al.Ultrasound-assisted extraction，HPLC analysis，and antioxidant activity of polyphenols from unripe apple［J］.J Sep Sci，2012，35（16）：2138-2145.

（2013-11-12收稿 責任編輯：曹柏）

Hepatoprotective Role of App le Polyphenols against Immunological Liver Injury in M ice

Wang Fang1，2，Xue Yang1，2，Yang Jingyu1，2，Wang Huan1，2，Wu Chunfu1，2
（1 Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China；2 Liaoning Plant Polyphenols Research and Development Technology Research Center，Shenyang 110016，China）

Objective：To observe hepatoprotective role of apple polyphenols（AP，Appjfnol?）on immunological liver injury inmice.Methods：An immunological liver injurymodel inmicewas established by intravenous injection of Bacillus Calmette-Guerin（BCG）and lipopolysaccharide（LPS）.The liver index and spleen index，the activities of serum aspartate aminotransferase（AST）and alanine aminotransferase（ALT），the levels of serum total protein（TP），albumin（Alb）and albumin/globulin（A/G）were detected.Histopathologic changewasalso investigated by HE staining.Results：AP inhibited the increases of liver index and spleen index，prevented the increase of serum AST activity and the decrease of serum TPand Alb levels.Histopathological abnormalitieswere also improved after AP adm inistration.Conclusion：AP played a significant hepatoprotective role against BCG and LPS induced immunological liver injury in mice.

Apple polyphenols；Bacillus Calmette-Guerin；Lipopolysaccharide；Immunological liver injury

R-332；R593.9

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.09.029

沈陽市科學技術項目計劃資助（編號：F13-318-1-20）

吳春福（1952.2—），男，博士，教授，沈陽藥科大學校黨委書記，研究方向：天然產物活性研究，E-mail：wucf＠syphu.edu.cn，chunfuw＠gmail.com