基質金屬蛋白酶9基因-1562C/T多態性與廣東漢族人群社區獲得性肺炎的關聯研究

張永標，劉小云，符永玫，畢筱剛，張扣興

基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)為MMPs家族中的成員之一，可以降解明膠、彈性蛋白、Ⅳ型和Ⅴ型膠原，在血管形成、組織再生、動脈粥樣病變、細胞遷移、腫瘤轉移等病理和生理過程中發揮著重要作用[1]。有研究表明，MMP-9基因啟動子-1562C/T位點的多態性與一些呼吸系統疾病如慢性阻塞性肺疾病(COPD)和肺結核有關[2-3]，而目前國內外關于MMP-9及其基因-1562C/T多態性與社區獲得性肺炎(community acquired pnenmonia，CAP)的關系則少有報道。本研究對廣東漢族人群社區CAP患者血清MMP-9的水平、MMP-9基因-1562C/T的基因型與等位基因進行了檢測，并以健康廣東漢族人群為對照，旨在揭示MMP-9是否參與了CAP的病理過程，以及MMP-9基因-1562C/T多態性對廣東漢族人群CAP的遺傳易患性及對MMP-9的表達水平是否存在影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 病例組 納入2012年5—12月中山大學附屬第三醫院門急診和住院診治的廣東漢族CAP患者100例為病例組，其中男44例，女56例；年齡23～61歲，平均(37.4±2.1)歲。患者符合2006年中華醫學會呼吸病學分會制定的《社區獲得性肺炎診斷和治療指南》的臨床診斷標準[4]：(1)新近出現的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病癥狀加重，并出現膿性痰，伴或不伴胸痛；(2)發熱；(3)肺實變體征和/或聞及濕性啰音；(4)白細胞計數>10×109/L或<4×109/L，伴或不伴細胞核左移；(5)胸部X線檢查顯示片狀、斑片狀浸潤性陰影或間質性改變，伴或不伴胸腔積液。以上(1)～(4)項中任何一項加第(5)項，并排除肺結核、肺部腫瘤、非感染性肺間質性疾病、肺水腫、肺不張、肺栓塞、肺嗜酸粒細胞浸潤癥及肺血管炎后，即可明確臨床診斷。排除標準為：(1)其他肺部基礎疾病如COPD、哮喘、支氣管擴張癥、肺結核等；(2)心腦血管疾病如高血壓、冠心病、心力衰竭、腦卒中及其后遺癥等；(3)自身免疫性疾病如類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化等；(4)代謝性疾病如糖尿病等；(5)應用激素或免疫抑制劑；(6)各種腫瘤性疾病；(7)慢性肝炎、肝硬化；(8)慢性腎功能不全。患者均有發熱癥狀(最高腋下體溫≥37.3 ℃)。

1.1.2 對照組 以同期本院門診體檢的健康廣東漢族體檢者96例為對照組，其中男42例，女54例；年齡20～60歲，平均(38.1±1.5)歲。廣東漢族人群指3代以上均為漢族血緣且籍貫為廣東省，受試者之間均無血緣關系。本研究獲得中山大學附屬第三醫院倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。病例組與對照組的性別構成、年齡比較，差異無統計學意義(χ2= 0.001，P=0.972；t=0.675，P=0.512)。

1.2 標本收集與保存 采集病例組發病期(處于發熱期間)和對照組空腹外周靜脈血6 ml分別置于干燥管和乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管。病例組治療后(最高腋下體溫≤37.2 ℃后1周)再采集空腹外周靜脈血3 ml置于干燥管。干燥管室溫靜置30 min后，2 000 r/min離心15 min，離心半徑為10 cm,取上清至已消毒EP管中，待測MMP-9；EDTA抗凝管中全血采用血液基因組提取試劑盒(TIANamp Blood DNA Kit，北京天根科技有限公司)提取全血DNA作為PCR模板，具體操作嚴格按試劑盒說明書進行。將分離后的血清和提取所得的基因組DNA均置于-80 ℃冰箱凍存備用，全部標本收集完畢后統一檢測。

1.3 血清MMP-9水平測定 應用人MMP-9 ELISA 試劑盒(KE1175 Human MMP-9 ELISA Kit，美國Immunoway公司)，采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)方法檢測血清中MMP-9水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4 MMP-9基因-1562C/T多態性分析 采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法分析病例組與對照組MMP-9基因-1562C/T位點的多態性。應用Primer 5.0軟件設計引物，上游引物序列為5′-GCCTGGCACATAGTAGGCCC-3′，下游引物序列為5′-CTTCCTAGCCAGCCGGCATC-3′，并委托美國Invitrogen公司合成，產物長度436 bp。PCR反應體系為模板DNA 20～100 ng，10×PCR Buffer 2.5 μl，MgCl21.5 mmol，Premix Ex TaqTM酶(日本TAKARA公司)0.75 U，dNTPs 200 μmol，200 nmol/L上、下游引物各1.0 μl，用ddH2O補足至終體積20.0 μl。PCR反應條件為94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s、63 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s(35次循環)，最后72 ℃延伸10 min。對PCR產物采用限制性內切酶Sph I(日本TAKARA公司)進行酶切，酶切體系為PCR產物10.0 μl，10×H Buffer 2.0 μl，Sph I內切酶1.0 μl，ddH2O 7.0 μl，終體積20.0 μl，37 ℃水浴過夜消化。酶切后產物分析采用2%瓊脂糖凝膠電泳法，電泳后僅有436 bp一條條帶為CC基因型，有242 bp、194 bp兩條條帶為TT基因型，有436 bp、242 bp、194 bp三條條帶為CT基因型。

1.5 MMP-9基因-1562C/T PCR產物測序分析 隨機抽取酶切后產物電泳結果顯示為CC、CT、TT基因型的酶切前PCR產物各5份，送美國Invitrogen公司進行測序，以驗證酶切后產物電泳結果。測序獲得的核苷酸序列在-1562位堿基處僅有C單峰為CC基因型，僅有T單峰為TT基因型，有CT雙峰為CT基因型。

2 結果

2.1 病例組與對照組血清MMP-9水平比較 病例組發病期、治療后和對照組的血清MMP-9水平分別為(342.85±107.63)、(203.57±80.61)、(184.74±93.46)μg/L。病例組發病期MMP-9水平高于治療后和對照組，差異有統計學意義(t配對=4.512，t=5.305，P<0.05)；病例組治療后MMP-9水平與對照組比較，差異無統計學意義(t=2.429，P=0.143)。

2.2 PCR產物測序與酶切后電泳結果 酶切后產物2%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，病例組CC基因型73例、CT基因型27例；對照組CC基因型71例、CT基因型25例；兩組均未檢測到TT基因型。部分酶切后產物電泳圖譜見圖1。隨機抽取的酶切前PCR產物測序結果與酶切后產物電泳結果所示基因型完全一致。

注：M為DNA Marker DL2000，1、2、3、5、6、8泳道為CC基因型，4、7泳道為CT基因型

圖1 PCR產物酶切后凝膠電泳圖

Figure1 Electrophoregram of enzymolysis PCR produce

2.3 Hardy-Weinberg平衡分析結果 病例組與對照組基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律(P>0.05，見表1)。

表1 病例組與對照組-1562C/T基因型的Hardy-Weinberg平衡分析 (例)

Table1 Hardy-Weinberg balance analysis of genotypes of the MMP-9 gene -1562C/T between the case group and the control group

2.4 -1562C/T基因型及等位基因頻率分布 兩組CC基因型、CT基因型的頻率分布比較，差異無統計學意義(P>0.05)；C等位基因和T等位基因的頻率分布比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表2)。

表2 病例組與對照組-1562C/T基因型頻率及等位基因頻率分布比較〔n(%)〕

Table2 Comparison of genotypes and alleles distribution of the MMP-9 gene -1562C/T between the case group and the control group

組別例數 基因型CC CT TT等位基因C T對照組9671(74 0)25(26 0)0167(87 0)25(13 0)病例組10073(73 0)27(27 0)0173(86 5)27(13 5)χ2值0 0230 020P值0 8790 889

2.5 -1562C/T基因型對血清MMP-9水平的影響 病例組CC基因型與CT基因型患者發病期血清MMP-9水平，對照組CC基因型與CT基因型者血清MMP-9水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表3)。

Table3 Comparison of the serum MMP-9 level between different genotypes of the MMP-9 gene -1562C/T between the case group and the control group

組別例數MMP-9CC CTt值P值對照組96175 23±89 46169 36±93 340 9760 160病例組100314 13±125 13320 29±118 121 2900 100

注：MMP-9=基質金屬蛋白酶9

3 討論

MMP-9基因定位于人類染色體20q11.1-13.1上，其轉錄和表達受上游啟動子的調控，多種炎性細胞因子和生長因子通過與啟動子上的轉錄因子結合位點或抑制元件結合后，可啟動或關閉MMP-9基因的表達[1]。因此，MMP-9基因啟動子上一些位點的單核苷酸多態性和機體內MMP-9的水平與某些疾病的發生、發展存在著密切關系。

有研究表明MMP-9參與了肝纖維化、急性冠脈綜合征、急性腦梗死等疾病的發病過程[5-7]。本研究結果顯示，CAP患者發病期血清MMP-9水平較對照組明顯升高，而在治療后又明顯下降，且降至與對照組無統計學差異的水平，提示MMP-9參與了CAP的炎性反應過程。此外有研究結果認為，循環中MMP-9的水平以及MMP-9與基質金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)的比值(MMP-9/TIMP-1)尚可作為判斷CAP病情嚴重性的指標[8]。國外有研究發現，在肺炎支原體引起的成人CAP患者中，外周血單個核細胞(PBMCs)MMP-9的表達和血清MMP-9的水平在急性期顯著高于恢復期，且血清MMP-9的水平與外周血白細胞有關，說明CAP時MMP-9水平升高的主要原因之一是由于白細胞高水平表達MMP-9[9]。MMP-9可降解胞外基質中的Ⅳ型膠原，有利于促進中性粒細胞、淋巴細胞等炎性細胞向炎癥部位遷移。至于MMP-9在CAP中的誘導產生和作用機制等尚待于進一步研究。

本研究中病例組與對照組MMP-9基因啟動子-1562C/T位點的CC、CT、TT基因型及C、T等位基因分布無統計學差異，不同基因型的患者之間和對照組血清MMP-9的水平亦均無統計學差異。以上結果揭示了廣東漢族人群MMP-9基因-1562C/T多態性與CAP的遺傳易患性無關，且不影響MMP-9的表達水平。本研究結果與Chiang等[10]報道的MMP-9基因多態性與CAP關系的研究結果相同。有關-1562C/T多態性對MMP-9表達水平影響的研究結果并不一致。國外Demacq等[ 11 ]研究發現，巴西健康白人MMP-9基因-1562C/T多態性對MMP-9的表達水平無明顯影響。Ghaderian等[12]報道急性心肌梗死患者-1562C/T位點TT和CT基因型的血清MMP-9水平明顯高于CC基因型。MMP-9表達調節的機制目前尚不明確，因而無法對這些研究結果給予合理解釋。本研究中CAP患者的血清MMP-9水平明顯升高，-1562C/T多態性不影響CAP患者和對照組MMP-9的表達水平，提示CAP時MMP-9的轉錄和表達可能受到MMP-9基因啟動子上其他多態性位點的調控，或存在其他影響MMP-9分泌、活化的調節機制。

綜上所述，MMP-9參與了CAP的炎性反應過程，MMP-9基因-1562C/T多態性與廣東漢族人群CAP的易患性無關，且不影響MMP-9的表達水平。本研究對象為廣東漢族人群，Chiang等[10]的研究對象為未分種族的臺灣地區人群。本研究中病例組與對照組的基因型分布經Hardy-Weinberg平衡分析表明樣本具有群體代表性，由于不同區域和種族的人群中MMP-9基因的多態性可能不完全相同，因此本研究的局限性在于其結果僅可反映廣東漢族人群，尚不代表中國其他種族人群或其他區域漢族人群。對于廣東漢族人群MMP-9基因啟動子中非-1562C/T位點、中國其他種族人群或其他區域漢族人群MMP-9基因啟動子中包括-1562C/T位點的多態性與CAP遺傳易患性的關系及其對MMP-9表達水平的影響等均值得更進一步研究。

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