鎂離子在高磷誘導慢性腎衰竭大鼠胸主動脈血管鈣化中的作用及機制研究

張俊霞，徐金升，王雙宇，白亞玲，張勝雷，崔立文，張慧然

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患者的主要并發癥之一[1-2]，血管、心臟瓣膜和心肌鈣化是導致CKD患者發生CVD的重要原因。流行病學調查顯示，40%的CKD患者發生血管鈣化[3-4]。血管鈣化是由多種細胞、分子參與的類似于骨形成和骨質疏松發生的主動調節過程，是預測CVD病死率的一個獨立危險因素[5]，但其發生機制迄今尚未完全闡明。血管平滑肌細胞是血管中膜最主要的細胞成分，其發生類成骨/成軟骨樣的表型轉化是血管鈣化的關鍵環節，其特點是出現骨源性基因的表達上調，尤其是核心結合因子α1(core binding factor α1,Cbfα1)被視為表型轉化的標志物。隨著對血管鈣化研究的逐漸深入，發現鎂離子對血管鈣化有保護性作用[6-8]，但目前尚不清楚鎂離子對CKD患者的血管鈣化是否有保護作用。為此，本研究建立了慢性腎衰竭大鼠血管鈣化模型，通過外源性補充鎂離子，觀察其對血管鈣化及彈性功能的影響，并對其機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠，32只，雄性，5周齡，購自河北醫科大學實驗動物中心，合格證號：1210076。

1.2 主要儀器和試劑 甲基纖維素、硫酸腺嘌呤(美國sigma公司)；動物飼料(北京華阜康生物有限公司)；RNA提取試劑盒、RNA反轉錄試劑盒(美國thermo公司)；鈣水平測定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)；Unicel Dxc800全自動生化分析儀(Beckman公司)；所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司根據設計合成(見表1)。

表1 引物序列

注：Cbfα1=核心結合因子α1；GADPH為內參基因

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及造模方法 將大鼠采用隨機數字表法均分為4組，即對照組(A組)、慢性腎衰竭血管鈣化組(B1組)、低鎂組(B2組)、高鎂組(B3組)。參照文獻[9]制備大鼠血管鈣化模型,將32只健康雄性SD大鼠適應性喂養高磷飼料2周后進入實驗。A組給予1.5%甲基纖維素6 ml/kg在1～3周時每天灌胃，4～15周時給予高磷飲食(P：1.2%、Ca：1%、 Mg：0.05%)。B1組1～3周時給予硫酸腺嘌呤懸濁液(硫酸腺嘌呤溶于1.5%甲基纖維素中制成100 mg/ml的懸濁液)6 ml·kg-1·d-1灌胃，4～15周時給予高磷飲食(P：1.2% 、Ca：1%、 Mg：0.05%)。B2組1～3周時給予硫酸腺嘌呤懸濁液6 ml·kg-1·d-1灌胃，4～15周時給予高磷低鎂飲食(P：1.2%、Ca：1%、Mg：0.02%)。B3組1～3周時給予硫酸腺嘌呤懸濁液6 ml·kg-1·d-1灌胃，4～15周時給予高磷高鎂飲食(P：1.2%、Ca：1%、Mg：0.15%)。

1.3.2 主動脈脈搏波速率(PWV)的測定及動脈血管標本的采集 實驗15周末，用2%戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉所有大鼠，暴露頸動脈及股動脈，全身肝素化后插入腰椎麻醉導管，用多導電生理儀測量波形，解剖大鼠后測定兩導管尖端距離，計算PWV值?？焖偃〈笫笮刂鲃用}置于凍存管中，放于液氮罐中保存，留取做反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)；取部分腹主動脈進行von Kossa染色法[10]測定主動脈鈣化情況。剩余腹主動脈烤干至質量不再改變，留取測量鈣水平。慢性腎衰竭血管鈣化造模成功的標準：腎臟HE染色腎小管內可見棕黑色結晶,異物巨細胞肉芽腫形成,灶狀腎小管擴張,間質灶片狀淋巴單核細胞浸潤伴纖維化；主動脈von Kossa染色后，主動脈血管中膜可見棕黑色顆粒沉積；血肌酐、尿素氮、血磷均高于A組。

1.3.3 RT-PCR法檢測血管組織中Cbfα1 mRNA的表達 采用RNA分離試劑盒Trizol提取并純化組織總RNA。分光光度法測定提取的總RNA水平。PCR反應在ABI5700型PCR儀上進行，反應條件為：95 ℃預變性5 min,95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s(共35個循環)，最后于72 ℃延伸10 min。取PCR產物，在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳(120 V 30 min)，凝膠圖像成像系統拍攝保存實驗結果，凝膠圖像分析系統(GelPro Analyzer 3.0)分析Cbfα1與GADPH基因條帶吸光度值。Cbfα1 mRNA的表達量采用gel-Image J軟件計算灰度值。

1.3.4 血管壁鈣水平的測定 取腹主動脈烤干至質量不再改變后稱重，置于1 mmol/L的鹽酸中37 ℃消化過夜，用鈣水平測定試劑盒(鄰甲酚酞絡合酮比色法)，酶標儀測定。血肌酐、尿素氮、血鈣、血磷、血鎂水平的測定由Unicel Dxc800全自動生化分析儀檢測。

2 結果

2.1 慢性腎衰竭大鼠血管鈣化模型的構建 B1組血肌酐、尿素氮、血磷水平分別為(172.6±10.8) μmol/L、(23.9±2.2) mmol/L 、(3.8±0.1) mmol/L，高于A組的(37.7±4.8) μmol/L、(6.5±0.4) mmol/L 、(2.5±0.1) mmol/L，差異均有統計學意義(t=32.284、22.010、26.000，P<0.05)；腎臟病理改變：腎小管內可見大量棕黑色結晶,異物巨細胞肉芽腫形成,灶狀腎小管擴張,部分可見少量蛋白管型,間質灶片狀淋巴單核細胞浸潤伴纖維化(見圖1)；B1組主動脈von Kossa染色后，主動脈血管中膜可見大量棕黑色顆粒沉積(見圖2A)。

2.2 4組血鎂水平比較 A組血鎂水平為(0.9±0.1)mmol/L、B1組為(0.9±0.5) mmol/L、B2組為(0.6±0.5) mmol/L、B3組為(1.4±0.6) mmol/L，4組間差異有統計學意義(F=7.745，P<0.05)。B3組血鎂水平高于B2組，差異有統計學意義(q=2.897，P<0.05)。

2.3 4組胸主動脈鈣化及鈣水平比較 A組主動脈鈣水平為(2.9±0.3) μg/mg、B1組為(8.1±0.6) μg/mg、B2組為(12.4±0.7) μg/mg、B3組為(5.3±0.6) μg/mg，4組間差異有統計學意義(F=6.824，P<0.05)。B2組主動脈鈣水平高于B1組，差異有統計學意義(q=13.192，P<0.05)；B1組主動脈鈣水平高于A組，差異有統計學意義(q=21.925，P<0.05)；B3組主動脈鈣水平低于B1組和B2組，差異有統計學意義(q=9.333、21.782，P<0.05)。von Kossa染色及主動脈鈣水平測定發現B1組發生了明顯的主動脈鈣化(見圖2A)，B2組主動脈鈣化更加嚴重(見圖2B)，B3組主動脈鈣化明顯減輕(見圖2C)。

注：大鼠腎臟間質灶片狀淋巴單核細胞浸潤伴纖維化

圖1 慢性腎衰竭血管鈣化大鼠腎臟病理結果(HE染色，×200)

Figure1 Pathology results of the chronic renal failure rats with vascular calcification

注：A為B1組主動脈鈣化情況,大鼠主動脈血管中膜大量棕黑色顆粒沉積；B為B2組主動脈鈣化情況；C為B3組主動脈鈣化情況

圖2 大鼠胸主動脈鈣化情況(von Kossa染色，×100)

Figure2 The rat thoracic aortic calcification

2.4 4組胸主動脈PWV值比較 A組胸主動脈PWV值為(1.3±0.1) m/s、B1組為(2.9±0.3) m/s、B2組為(6.1±0.6) m/s、B3組為(2.1±0.3) m/s，4組間差異有統計學意義(F=6.454，P<0.05)。B2組主動脈PWV值高于B1組，差異有統計學意義(q=13.492，P<0.05)；B1組PWV值高于A組，差異有統計學意義(q=14.311，P<0.05)；B3組PWV值低于B1組和B2組，差異有統計學意義(q=5.333、16.865，P<0.05)。

2.5 4組胸主動脈血管Cbfα1 mRNA表達情況比較 A組胸主動脈Cbfα1 mRNA表達量為(0.56±0.03)、B1組為(0.67±0.03)、B2組為(1.72±0.24)、B3組為(0.54±0.02)，4組間差異有統計學意義(F=3.212，P<0.05)。B1組和B2組Cbfα1 mRNA表達量高于A組，差異有統計學意義(q=7.333、13.565，P<0.05)；B3組Cbfα1 mRNA表達量低于B1組和B2組，差異有統計學意義(q=10.198、13.858，P<0.05)；B2組Cbfα1 mRNA表達量高于B1組，差異有統計學意義(q=12.279，P<0.05，見圖3)。

注：Cbfα1 =核心結合因子α1

圖3 大鼠胸主動脈Cbfα1 mRNA表達情況

Figure3 The rat thoracic aorta Cbfα1 mRNA expression

3 討論

近年研究發現，血管鈣化是類似骨發育的、主動的、可調控的、多種因素綜合作用的生物學過程[11-12]。CKD患者的血管鈣化除了受傳統危險因素影響外，還與尿毒癥相關因素有關，如高磷血癥[13-15]。本研究發現，大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞在高磷培養基中出現了鈣化，該鈣化過程可以被鎂離子有效抑制，與文獻報道一致[16-17]。

鎂是體內占第4位的陽離子,其中60%在骨骼中,是骨鹽的組成成分[18]。鎂具有多種生理功能,包括調節各種離子通道的電子流，催化多種酶活性，調節細胞生長、再生和膜結構，維持心肌、骨骼肌及胃腸道平滑肌興奮性等[19-20]。本研究在慢性腎衰竭大鼠血管鈣化模型上發現，B2組主動脈血管鈣化更嚴重，血管內膜、外膜也發生了鈣化,血管組織鈣水平也更高；B3組主動脈血管鈣化程度則明顯減輕，提示鎂離子具有抑制血管鈣化的作用。

為了探討鎂離子對血管鈣化抑制作用的具體機制，本研究進一步檢測了胸主動脈Cbfα1 mRNA的表達情況，發現B1組大鼠主動脈Cbfα1 mRNA的表達量較對照組明顯增加，與Montezano等[21]報道的結果一致。Cbfα1作為平滑肌細胞發生表型轉化的標志物，提示高血磷誘導慢性腎衰竭大鼠胸主動脈平滑肌細胞發生了表型轉化，平滑肌細胞表型轉化是血管鈣化尤其是中膜鈣化發生的關鍵步驟，這從平滑肌細胞表型轉化的角度也解釋了為什么高磷可以導致血管鈣化。本研究結果顯示，B3組的胸主動脈Cbfα1 mRNA表達量低于B1組、鈣化減輕，提示鎂離子有可能是通過抑制平滑肌細胞表型轉化來抑制血管鈣化的。但其具體作用機制還有待進一步研究。同時本研究還發現，B3組主動脈PWV值明顯低于B1組，提示B3組血管彈性功能明顯優于B1組，更加印證了鎂離子具有抑制血管鈣化的作用。

綜上所述，鎂離子可能是通過抑制高磷誘導血管平滑肌細胞表型轉化來抑制血管鈣化、改善血管彈性功能的，有望成為防治血管鈣化的有效藥物之一。但本研究僅在基因水平上進行了驗證，且為動物模型，因此將其結果外推到人還需在蛋白水平、血管鈣化的分子機制及改變研究對象上進行深入研究。

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