應用主成分和聚類分析法探索慢性阻塞性肺疾病表型的臨床研究

吳饒仙，況九龍

隨著對慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)炎性反應的深入研究，發現COPD是一個全身炎性反應疾病，不僅可以累及肺臟，同時還可以引起很多的肺外效應[1]，如惡病質、肌肉萎縮、骨質疏松、心血管疾病等[2]。Han[3]等提出了COPD表型的概念，其含義是指能反映COPD不同患者間差異的一種或幾種疾病特征，與臨床預后(癥狀、疾病加重、對治療的反應、疾病進展率或者病死率)相關。早在50年代將肺氣腫分為紅喘型(PP型)、紫腫型(BB型)兩種[4]，但這些都是基于患者臨床特征的主觀判斷。目前COPD表型研究尚處于起步階段，大多數的研究都是從一個臨床表現或生理變化的特征進行分類，如臨床癥狀表型、1 s用力呼氣容積(FEV1)快速下降表型、氣道疾病和肺氣腫表型、頻發急性加重表型、全身炎性反應表型等，這些不同的表型說明了COPD的異質性[5]。實際上，各表型間存在交叉和交互現象，所以COPD表型的研究就顯得十分復雜和困難，并成為目前COPD研究的熱點。本研究旨在通過對江西籍COPD患者臨床特點，包括吸煙指數、年齡、性別、呼吸困難程度、氣流受限程度、合并癥、血清炎性因子水平等資料進行主成分分析(PCA)和聚類分析，可能將患者分為不同臨床表型，以期發現COPD患者間的差異性，從而區分出具有獨特預后或治療特征的COPD患者，為使用更為恰當的治療方法提供依據，實現個體化管理。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取南昌大學第二附屬醫院2011—2012年呼吸內科收治住院的主要診斷為COPD的患者157例，均符合中華醫學會呼吸學會制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》2011修訂版的標準[6]。排除：(1)診斷明確的其他肺部疾病患者，如肺炎、哮喘、支氣管擴張等；(2)妊娠、哺乳期患者。

1.2 研究方法 所有患者均于清晨抽取空腹肘靜脈血5 ml，置于無菌玻璃試管內，靜置30 min，再給予1 000 r/min離心15 min，離心半徑為0.5 cm，分離血清，-20 ℃低溫冰箱中保存待測。白介素8(IL-8)、白介素-32(IL-32)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的測定采用酶聯免疫吸附法(ELISA)，IL-8和TNF-a試劑盒由深圳晶美生物工程有限公司(美國Genzyme公司特許分裝)提供，嚴格按照藥品說明書進行操作。

1.3 分析指標 年齡、性別、吸煙指數、呼吸困難程度〔根據國際呼吸困難程度量表(MMRC)：0分，只在劇烈運動時呼吸困難；1分，快走或上坡時感到呼吸困難；2分，由于呼吸困難比同齡人走得慢或者以自己的速度在平地上行走時需要停下來呼吸；3分，在平地上行走100米或數分鐘后需要停下來呼吸；4分，明顯呼吸困難而不能離開房屋或換衣服時也感到氣短〕、合并癥(包括冠心病、高血壓、心力衰竭、糖尿病)、1 s用力呼氣容積占用力肺活量比值(FEV1/FVC)(GOLD分級根據氣流受限程度：1、FEV1/FVC<70%，FEV1占預計值%>80%；2、FEV1/FVC<70%，50%≤FEV1占預計值%<80%；3、FEV1/FVC<70%，30%≤FEV1占預計值%<50%；4、FEV1/FVC<70%，FEV1占預計值%<30%或FEV1占預計值%<50%合并呼吸衰竭)、IL-8、IL-32、TNF-α。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行統計分析。參與此次橫斷面研究的研究對象共157例，8項變量數據資料搜集完全有122例，余35例因缺乏肺功能資料而未進行分析。在聚類進行之前先根據反映各類特性的變量對原始數據進行預處理。因變量之間存在相互作用，故進行PCA分析，特征值≥1作為主要成分，減少變量間的相互作用，然后在PCA基礎上進行最小方差聚類分析法分析得出樹狀圖，獲取COPD表型分類，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 根據GOLD分級進行分類 122例研究對象參與分析，其中94例為男性患者；年齡為53～89歲，平均年齡為(72±7)歲。不同GOLD分級FEV1占預計值%、FEV1/FVC、呼吸困難程度間差異有統計學意義(P<0.05)，而年齡、性別、吸煙指數及IL-8、IL-32、TNF-α水平間差異無統計學意義(P>0.05，見表1)。

2.2 8個臨床變量聚類分析法分析 所有變量可分成3類(見圖1)，說明變量之間并非完全獨立。

2.3 8個變量的PAC分析 將8個指標所有數據進行PAC分析，得出3個主要成分(特征值>1，見表2)，在所有變量中方差累積貢獻率約為73.1%。主成分1包括 IL-8、IL-32、TNF-α；主成分2包括年齡、FEV1占預計值%；主成分3包括年齡、合并癥、呼吸困難程度；成分4～8因特征值<1不繼續分析。

表1 122例COPD患者的特征按GOLD分級結果Table 1 Characteristics of the 122 chronic obstructive pulmonary disease subjects according to GOLD stage

注：FEV1占預計值%=1 s用力呼氣容積占預計值百分比，FEV1/FVC=1 s用力呼氣容積占用力肺活量比值，IL-8=白介素8，IL-32=白介素32，TNF-α=腫瘤壞死因子α

注：水平長度表示變量之間的相似程度；FEV1=1 s用力呼氣容積，TNF-α=腫瘤壞死因子α，IL-8=白介素8，IL-32=白介素32
圖1 8個臨床變量系統聚類所得樹狀圖
Figure1 Dendrogram illustrating the results of the cluster analysis of clinical variables

表2 主成分分析各成分的總方差Table 2 The total variance of the main components of PCA

注：特征值>1為主成分

表3 主成分分析3個主成分的矩陣Table 3 The matrix of three main components of PCA

2.4 122例COPD患者的聚類分析 122例COPD患者在PCA分析得到三個主要成分的基礎上進行聚類分析得到的樹狀圖(見圖2)。經過偽F和偽t2檢驗將所有研究對象分為四類(見表4)，從表中我們可獲知不同的表型之間存在明顯的差異。(1)相對老年患者，吸煙指數高，中重度氣流受限，重度呼吸困難，合并癥少，炎癥指標明顯升高；(2)老年患者，中度氣流受限，中度呼吸困難，吸煙指數低，合并癥多，炎癥指標明顯升高；(3)與第2類比較，第3類為相對年輕患者，重度氣流受限，重度呼吸困難，合并癥少，吸煙指數低，炎癥指標輕度升高；(4)與第1類比較，第4類患者吸煙指數低，合并癥少，輕度呼吸困難，炎癥指標升高不明顯。1組與4組用FEV1不能區分，進行獨立樣本t檢驗，除年齡外余指標P<0.05，均有統計學意義。2組與3組除年齡外，余指標P<0.05，均有統計學意義。

3 討論

COPD是一個高發病率的呼吸系統慢性病，起病隱匿，臨床表現不典型，難以讓患者引起重視，而COPD的患病率、死亡率均逐年攀升。在全球范圍內，COPD在所有慢性病中高居第4位[7]，預計到2030年，COPD將成為全球第3位死亡原因[8]。2011年COPD全球策略修訂版對COPD的定義進行了更新[9]：COPD是一種可以預防和治療的常見疾病，其特征為持續存在的氣流受限，氣流受限呈進行性發展，伴有氣道和肺對有害顆粒或氣體導致的慢性炎性反應的增加，急性加重及合并癥影響患者整體疾病的嚴重程度。慢性炎癥是目前患者發病機制的主流觀點。無論是在穩定期、還是在急性加重期，系統性的炎癥可能是COPD患者產生全身效應的原因。

注：每個小格表示1例患者，水平長度表示患者之間特征的相似程度
圖2 122例COPD患者系統聚類所得的樹狀圖
Figure2 Dendrogram illustrating the results of the cluster analysis in 122 chronic obstructive pulmonary disease subjects

表4 基于主成分分析后122例COPD患者聚類分析結果Table 4 Characteristics of the 122 chronic obstructive pulmonary disease subjects according to the four phenotypes identified using principal component analysis-based cluster analys

注：*表示與1組比較，P<0.05；△表示與2組比較，P<0.05

慢性炎癥讓COPD的臨床表現愈發復雜、多樣，使COPD呈現出異質性。為了更好地研究COPD,從紛雜的臨床表現中發現COPD的個體化差異而進行個體化治療。然而臨床上COPD的診斷，仍主要以肺功能為金標準，在評估方面，也僅僅以FEV1作為單一的評估指標。2011版GOLD在評估COPD患者方面，做出了巨大的調整，綜合多個指標對COPD進行多維的評估，以便盡可能地對COPD患者實現個體化治療。

聚類分析是將相似的研究對象歸類的過程。在此之前，很少研究使用聚類分析評估呼吸道疾病表型。本研究采用聚類分析方法的研究目的是利用這種方法對COPD患者進行歸類研究，探索GOLD分類不能識別的表型。曾有學者建議使用傳統的分類方法識別COPD表型，其實2型和3型描述的特征類似于傳統分類，我們也識別了GOLD不能識別的表型(1型和4型)。然而這些表型后續的縱向研究對提高了解COPD的發生發展過程非常重要。

PCA也稱主分量分析，是從多個數值變量之間的相互關系入手，利用降維的思想，將多個變量化為少數幾個互不相關的綜合變量的統計方法。這種方法最早應用于氣道疾病，特別適用于消除變量間重疊導致集群結構可能損壞的問題[10]。在聚類分析前，本研究使用PCA方法平均轉化并確認聚類分析中的變量。同時本研究在聚類分析前未使用PCA分析變量，對另一個群集初始變量的總數進行分析，獲得了三個表型，然而其中幾個變量重疊非常明顯，包括年齡、呼吸困難、炎癥指標、吸煙指數。這種重疊表明，沒有初始PCA聚類的表型鑒定可能沒有臨床意義，故PCA是聚類分析確認變量之前非常必要的轉化方式。

本研究采用這兩種方法對臨床收集的大量數據進行分析，結果與按GOLD分級進行的分類有明顯的區別，結果可以將研究對象分成4類：(1)相對老年患者，吸煙指數高，中重度氣流受限，重度呼吸困難，合并癥少，炎癥指標明顯升高；(2)老年患者，中度氣流受限，中度呼吸困難，吸煙指數低，合并癥多，炎癥指標明顯升高；(3)與第2類比較，第3類為相對年輕患者，重度氣流受限，重度呼吸困難，合并癥少，吸煙指數低，炎癥指標輕度升高；(4)與第1類比較，第4類患者吸煙指數低，合并癥少，輕度呼吸困難，炎癥指標升高不明顯。

本研究發現部分呼吸困難程度明顯不同的患者，氣流受限程度卻相似，分布在同一GOLD分類中。這說明COPD患者之間存在異質性，故臨床我們需要合多維指標對COPD患者進行分析。聚類分析臨床變量之間的關系，呼吸困難與FEV1僅表現為中度相關[11]。比較那些不能基于FEV1區別的受試者(表型1和4無法區分)，研究發現受試者隨著年齡的增加，呼吸困難程度加重，慢性心衰發病率增加，炎癥指標升高。推測，慢性心臟衰竭和體力活動的減少，或許影響呼吸困難程度加重。事實上，其他研究發現，受試者即使輕中度的氣流受限，也會導致日常活動下降，這與呼吸困難加重，慢性心臟衰竭和死亡率增加相關聯[12-13]。

本研究還發現GOLD分級相似的患者臨床特征大相徑庭，包括癥狀、合并癥和呼吸困難程度，但危險因素或死亡原因不同，患者使用吸入療法的效果可能不同。事實上，相對減少死亡率的風險不僅取決于有效的治療，同時也受死亡率基線分布的人群數量和各種共存的條件(如年齡、合并癥和吸煙)[14]。目前臨床通常根據氣流受限程度制定治療方案，我們認為這種策略適合以肺內疾病為主，如使用支氣管擴張劑后評估FEV1和癥狀，但不適合有嚴重肺外疾病的患者。因此，綜合患者自身情況制定個體化治療方案比以單一疾病為臨床指標指導合并多種慢性病患者的治療更為適宜。

隨著研究的深入還發現，COPD是一種以肺部炎癥為核心伴全身炎性反應的綜合征，多種生物標志物可能可以用來描述疾病不同時間段的發病機制及特征。我們也可以選擇生物標志物來解決疾病的具體問題或治療。TNF-α是一種與感染密切相關的細胞因子，具有多種前炎性遞質的功能，是免疫反應和炎性反應中的重要遞質，主要由單核細胞、巨噬細胞產生，可以誘導中性粒細胞釋放IL-8遞質[15-16]。IL-8趨化作用使氣道管腔內中性粒細胞聚集及管壁T淋巴細胞浸潤，并使其活性增加，從而在COPD氣道炎癥的發生發展過程中以及氣道阻塞中發揮重要作用。同時，中性粒細胞彈性蛋白酶的釋放又能誘導氣道上皮細胞IL-8基因的表達，引起其進一步分泌，形成惡性循環，導致氣道慢性炎癥和持續損傷[17]。

2005年，美國科羅拉多大學Dinarello等[18]在用基因芯片方法研究IL-18可誘導基因時發現了一種新型IL-32，簡稱IL-32。IL-32作為一種新發現的炎癥細胞因子，主要是由自然殺傷細胞、T細胞上皮細胞及周圍血中的單核細胞產生分泌[18-19]。2008年，Calabrese等[19]首次利用免疫組化技術研究了IL-32對COPD炎癥及病情發展的影響，研究結果表明IL-32在COPD患者中表達增加，參與了COPD特殊的免疫反應，并有可能影響疾病的進展。本研究發現IL-8、IL-32、TNF-α與年齡及吸煙指數呈正相關，與FEV1%呈負相關。但是IL-32的功能、在氣道反應中的作用途徑及各個亞型之間的相互作用仍不清楚。因此，IL-32在氣道炎癥中的更進一步研究可能為氣道炎癥治療提供新的切入點。

總之,目前根據GOLD分級不能準確地將COPD患者進行分層和指導治療，因為它不能區分患者明顯不同的表型。我們認為未來的臨床研究根據風險評估分析結果(如死亡率風險)，而不是某一個的參數(例如FEV1)。本研究使用PCA和聚類分析方法綜合評估COPD患者并將其進行分類，與先前應用單一的氣流受限指標分級進行疾病分期相比較，具有明顯的優越性，也說明了COPD的復雜性。這種方法還可以應用于其他具有不同特征的COPD患者進行分組。本研究認為使用PCA和聚類分析方法能更好地描述COPD的異質性，為臨床實踐和研究提供更有力的證據，最終的目的是為了尋找更優更適宜的個體化治療方法。

本研究前瞻性收集臨床資料，基于肺功能標準診斷COPD，聯合實驗室檢測COPD患者IL-8、IL-32、TNF-α水平，受試者包含GOLD所有分期病例，并且本研究使用的聚類分析法在PCA分析的基礎上分析，從而得出四個表型。但是，也存在很多的限制與不足：(1)數據不完整的研究對象不能參與分析。(2)由于時間和條件的限制，本研究的對象全部來自南昌大學第二附屬醫院呼吸內科，樣本含量有限，研究所得到的結果尚不能代表COPD患者的整體情況。(3)由于時間的局限，本研究只進行了橫斷面調査，沒有縱向評估各指標對COPD的長期效果。(4)根據臨床變量，肺功能檢查和實驗室檢測確定表型，沒有影像或問卷調查進行分析。擴大樣本含量，對表型的鑒定過程加入更多的其他相關變量如COPD發病機制(如支氣管擴張可逆性、峰流量變化、遺傳性過敏癥、α1-抗胰蛋白酶、肺氣腫或痰生產嗜酸粒細胞性氣道炎癥、呼出氣一氧化氮分數或其他生物標志物)可能會增加我們識別表型的準確性。目前臨床治療效果或一些治療反應，也有可能影響到我們臨床表型的鑒定。這些假說需要我們進一步的研究探索。

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