Gardiquimod對HepG2細胞中VEGF和TIMP1表達的影響

程豐偉，李 磊，王 芳，金 銳，羅 欣，張勝權

◇基礎醫學研究◇

Gardiquimod對HepG2細胞中VEGF和TIMP1表達的影響

程豐偉，李 磊，王 芳，金 銳，羅 欣，張勝權

目的研究Toll樣受體7（TLR7）的配體Gardiquimod 對HepG2細胞中血管內皮生長因子（VEGF）和基質金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP1）mRNA表達的影響，并分析其激活的信號通路。方法HepG2細胞經不同時間的Gardiquimod（2 μg／ml）處理后，提取細胞總RNA和總蛋白，RT-PCR分析VEGF和TIMP1轉錄水平的變化；Western blot分析絲裂原蛋白激活激酶－胞外信號調節激酶（MAPKs-ERK1／2）信號通路，并通過MAPKs-ERK1／2特異性阻斷劑PD98059阻斷相應的信號途徑，進而分析兩者的相關性。結果HepG2細胞中表達TLR7，但較外周血單個核細胞（PBMC）較少。Gardiquimod刺激HepG2 10 min后下調細胞中VEGF mRNA的表達，而刺激細胞30 min后TIMP1 mRNA的表達有明顯的上調；Western blot結果顯示，細胞中的ERK1／2的磷酸化水平明顯降低；并且ERK1／2的特異性抑制劑（PD98059）能有效抑制HepG2細胞中ERK1／2磷酸化作用。結論TLR7激活能夠下調HepG2細胞中VEGF的表達，并與ERK1／2信號通路相關；同時TLR7激活上調TIMP1的表達，但與ERK1／2信號通路無相關性。

TLR7；VEGF；TIMP1；HepG2；Gardiquimod

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是一類重要模式識別受體（patternrecognition receptors，PRR），不僅參與先天性免疫，而且在獲得性免疫中也發揮重要作用。TLR7能識別某些天然小分子抗病毒化合物和病毒單鏈RNA（single-stranded RNA，ssRNA），激活髓系分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴的信號通路，介導抗病毒免疫反應［1］。并且，TLR7亦可識別一些人工合成的咪唑喹啉類或鳥苷酸衍生物類的小分子化合物，如R848和Gardiquimod等。近年來研究［2］顯示TLR7不僅僅表達于免疫細胞，而且在部分癌細胞中也有表達，特別在血液腫瘤以及皮膚腫瘤中關于TLR7的研究常見報道，具體作用尚不明確，但TLR7與腫瘤的發生、遷移等密切相關。研究［3］顯示TLR7激活后具有促某些抗腫瘤的細胞因子表達，并對某些腫瘤的侵襲、轉移有一定抑制作用。臨床上將TLR7激動劑咪喹莫特作為治療血液系統腫瘤的方法，明顯減輕了慢性淋巴細胞白血病患者腫瘤的皮膚浸潤；TLR7配體咪喹莫特作用于原發性皮膚腫瘤后能激活核因子κB（NF-κB）信號途徑并且誘導促炎癥因子以及相關細胞因子的表達［4］。但TLR7對肝癌細胞中一些相關炎癥因子表達的影響尚不清楚，該研究以HepG2細胞為模式細胞，觀察TLR7激活后細胞中血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和基質金屬蛋白酶抑制劑1 （matrix metallo-proteinase inhibitor 1，TIMP1）表達的變化，并分析其相關的信號途徑。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑HepG2細胞株由本實驗室凍存；外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）細胞提取于新鮮血液。Gardiquimod、PD98059購于美國Sigma公司；TLR7及β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司；ERK1／2及p-ERK1／2抗體購于美國Cell signaling公司；RT-PCR試劑購于日本TaKaRa公司；逆轉錄試劑購于加拿大Fermentas公司；新生小牛血清、DMEM培養基購于美國Gibco公司；引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 引物登陸NCBI網站檢索GAPDH、VEGF、TIMP1基因序列（Human），Primer Premier 5.0軟件設計3對引物，見表1。

1.3 細胞培養將凍存的HepG2細胞復蘇并接種于25 ml的培養瓶中，加入5 ml含10%小牛血清并加入雙抗（青霉素與鏈霉素）的DMEM培養液，置5%CO2、37℃細胞培養箱中培養。細胞傳代2～3次后，狀態較佳時，使用胰酶消化細胞并將之接種于24孔細胞培養板，濃度約為5×104／孔；待細胞全部貼壁后換無血清的DMEM培養并加入Gardiquimod （2 μg／ml）刺激，時間分別為10、30 min，1、3、6、12、24、36 h，并設置空白對照。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.4 RT-PCR分析VEGF mRNA和TIMP1 mRNA水平的變化提取24孔細胞板中加藥刺激后細胞的總RNA，逆轉錄PCR（步驟遵循試劑盒說明書）合成cDNA模板以備下步使用。配制RT-PCR體系如下：每份加入SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10 μl，上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，Rox Reference DyeⅡ（50×）0.4 μl，上一步保存的cDNA模板2 μl，ddH2O 6.8 μl，總共20 μl體系，以GAPDH為內參，上機（7500型熒光定量PCR儀）檢測。

1.5 Western blot分析提取24孔細胞板中加藥刺激后細胞總蛋白，－20℃儲存備用。配制10% SDS聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣10 μl，設置60 V電壓進行Tris甘氨酸電泳緩沖液電泳，至溴酚藍超出分離膠后將電壓調至120 V，待溴酚藍泳至凝膠底部，結束電泳。設置150 mA，濕轉法將蛋白質冰上轉移至PVDF膜上，時間為3 h。將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，置于相應的一抗中，4℃結合過夜，取出PVDF膜，TBST洗膜3次，每次10 min，置于相應的二抗中室溫結合2 h；TBST洗膜3次，加入ECL發光劑，顯影壓片?？贵w濃度如下，抗β-actin：一抗1∶5 000，二抗1∶5 000；抗p-ERK：一抗1∶1 000，二抗1∶10 000；抗TLR7：一抗1∶500，二抗1∶5 000。

1.6 統計學處理采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，數據以±s表示，不同時間點之間的比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 TLR7在HepG2細胞的表達提取HepG2細胞的總蛋白，Western blot檢測細胞中TLR7蛋白的表達，設置PBMC作為對照組。結果顯示TLR7在HepG2細胞中表達，但表達量較PBMC略少，見圖1。

圖1 Western blot分析TLR7蛋白在HepG2細胞以及PBMC中的表達

2.2 不同時間的Gardiquimod對HepG2細胞VEGF和TIMP1的mRNA表達的影響TLR7配體Gardiquimod刺激HepG2細胞后RT-PCR分析VEGF mRNA和TIMP1 mRNA表達水平的變化。檢測結果顯示，TIMP1 mRNA水平在36 h內較空白對照組明顯上調，并且在6 h達到峰值；VEGF mRNA水平在36 h內較空白組顯著降低，在6 h表達水平又有一個短暫的回升，并在1 h時降至最低，見圖2。

圖2 Gardiquimod（2μg／ml）對HepG2細胞中VEGF、TIMP1 mRNA表達量的影響

2.3 Western blotp-ERK1／2的表達量較空白組顯著降低，6 h內呈時間依賴性，并在6 h表達最弱，見圖3。

圖3 Western blot分析p-ERK1／2蛋白表達

2.4 Gardiquimod與PD98059協同刺激HepG2細胞后對細胞中VEGF mRNA和TIMP1 mRNA表達的影響RT-PCR檢測顯示：①PD98059刺激HepG2細胞后，細胞中VEGF mRNA的表達量較空白對照組有下降的趨勢，見圖4，而Gardiquimod刺激細胞后也下調VEGF mRNA的表達量（圖2），并且磷酸化的ERK1／2的表達量有明顯的下調趨勢（圖3），由此推斷，Gardiquimod刺激細胞的過程可能與ERK1／2信號途徑相關。②PD98059下調TIMP1 mRNA的表達（圖4），但是Gardiquimod刺激細胞后下調ERK1／2的磷酸化并上調TIMP1 mRNA的表達（圖2、3），提示Gardiquimod上調TIMP1的表達與ERK1／2信號途徑可能無相關性。

圖4 PD98059和Gardiquimod協同刺激后HepG2細胞中VEGF mRNA和TIMP1 mRNA的相對表達量

2.5 特異性抑制劑對細胞中信號通路的影響Western blot檢測結果表明，p-ERK1／2的特異性抑制劑PD98059（100 μmol／L）能有效抑制HepG2細胞中ERK1／2磷酸化作用，見圖5。

圖5 特異性抑制劑對HepG2細胞中ERK1／2磷酸化的影響

3 討論

近年來研究［5］表明肝癌細胞中高表達VEGF，后者在腫瘤組織中促進血管生成，對于腫瘤細胞的增殖、遷移均不可或缺?；|金屬蛋白酶家族（MMPs）及基質金屬蛋白酶抑制劑家族（TIMPs）作為一對相輔相成的細胞因子，與腫瘤增殖、侵襲和遷移密不可分［6］。細胞外基質（ECM）是腫瘤侵襲和轉移的重要組織屏障，MMPs則是突破這個屏障最有效的裂解酶。TIMPs家族在ECM中可以抑制MMPs的活性，主要方式是通過與MMPs結合成緊密的非共價鍵復合物，從而調節MMPs的表達［7－8］。絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）是真核生物信號傳遞中最重要的途徑之一，MAPK接收胞外信號后活化，進入細胞核中激活相應的靶基因，參與基因表達調控、細胞質功能活動等。MAPK可促進血管內皮細胞的增殖以及新血管生成，是腫瘤發生和轉移中的重要因素［9］。ERK1／2是MAPK 4個最主要的亞族之一。有研究［10－11］表明ERK1／2在肝癌以及前列腺癌等多種腫瘤組織中均出現活性增強或者表達異常，而且，有研究［12］表明ERK1／2抑制劑可以將乳腺癌、卵巢癌和骨肉瘤等腫瘤細胞阻斷在S期，抑制腫瘤細胞增殖和生長；胃癌組織中ERK1／2和VEGF表達呈正相關，兩者在胃癌的發生、發展中共同促進了腫瘤的浸潤和轉移［13］。因此，ERK1／2表達調控異常與腫瘤的發生有著密切關系。

本研究提示2 μg／ml的Garquimod刺激HepG2細胞VEGF mRNA水平顯著下降，并在1 h時達到最低；并且細胞中TIMP1 mRNA水平顯著上升，并在6 h時達到峰值。磷酸化ERK1／2的表達量呈逐漸下降的趨勢，一定周期內具有時間依賴性，在6 h時達到最低。以上結果提示TLR7激活可能對HepG2細胞的增殖、遷移和侵襲有著一定程度的抑制作用；抑制劑研究結果提示，Gardiquimod下調細胞中VEGF的表達可能與ERK1／2的磷酸化相關，下調p-ERK可能是Gardiquimod抑制HepG2細胞VEGF表達的一個重要途徑。Gurdquimod上調TIMP1的表達這一效應具體是通過哪些信號途徑，有待進一步研究。并且，Gardiquimod對HepG2細胞的凋亡、遷移是否能發揮一定的生物學作用，還有待進一步的探討。

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Effects of Garquimod on the expression of VEGF and TIMP1 in HepG2 cells

Cheng Fengwei，Li Lei，Wang Fang，et al
（Dept of Biochemistry and Molecular Biology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the effect of Toll-like receptor 7（TLR7）ligand Gardiquimod on vascular endothelial growth factor（VEGF）mRNA and matrix metallo-proteinase inhibitor 1（TIMP1）mRNA in HepG2 cells，and to analyze their activiated signal transduction pathways.MethodsExtracted total RNA and total protein of cultured HepG2 cells，which were treated with Gardiquimod（2 μg／ml）for different time.The mRNA expression of VEGF and TIMP1 was measured by Real-time PCR，and analyzed the ERK1／2 signal transduction pathway by using Western blot.And to use the specific inhibitor of ERK1／2（PD98059）to block corresponding signaling pathways，then the correlation was analyzed.ResultsTLR7 was expressed in HepG2 cells，but less than that in peripheral blood mononuclear cells（PBMC）.After the HepG2 cells were treated with Gardiquimod for 10 min，the mRNA of VEGF in the cells was obviously reduced.However，when the cells were treated with Gardiquimod for 30 min，the mRNA of TIMP1 in HepG2 cells was obviously increased.Western blot results indicated that the phosphorylation of ERK1／2 in the cells was obviously downregulated.What’s more，the specific inhibitor of ERK1／2 （PD98059）could effectively suppress the phosphorylation of ERK1／2 in HepG2 cells.ConclusionTLR7 activation downregulates the expression of VEGF in HepG2 cells，and associates with ERK1／2 signal pathway；TLR7 activation raises the expression of TIMP1 at the same time，which is not related with ERK1／2 signal pathway.

TLR7；VEGF；TIMP1；HepG2；Gardiquimod

R 34

A

1000－1492（2014）05－0561－04

2014－01－05接收

國家自然科學基金（編號：81271748）

安徽醫科大學生物化學與分子生物學教研室，合肥230032

程豐偉，男，碩士研究生；

張勝權，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：sqz36＠yahoo.com