骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠肺氣腫模型治療機(jī)制的探討

王麗雁，吳 倩，王葉芳，汪偉民

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠肺氣腫模型治療機(jī)制的探討

王麗雁，吳 倩，王葉芳，汪偉民

目的通過(guò)研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）對(duì)大鼠肺氣腫模型血清和肺泡灌洗液（BALF）中白介素-17（IL-17）、白介素-6（IL-6）的影響以及肺組織病理學(xué)變化，探討B(tài)MSC對(duì)慢性阻塞性肺疾病（COPD）的干預(yù)機(jī)制。方法30只健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分成3組：正常對(duì)照組、肺氣腫模型組、BMSC治療組。通過(guò)氣管內(nèi)注射豬胰蛋白酶誘導(dǎo)建立肺氣腫模型后，經(jīng)大鼠尾靜脈注射BMSC進(jìn)行治療。兩周后處死大鼠，觀察肺組織病理學(xué)變化及血清和BALF中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞百分比。使用ELISA方法檢測(cè)血清和BALF中IL-17、IL-6水平。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，肺氣腫模型組和BMSC治療組BALF中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的百分比升高（P＜0.05），BMSC治療組較肺氣腫模型組顯著降低（P＜0.05）；ELISA法結(jié)果顯示肺氣腫模型組和BMSC治療組血清和BALF中IL-17、IL-6水平較正常對(duì)照組顯著升高，BMSC治療組明顯低于肺氣腫模型組（P＜0.05）；病理觀察肺氣腫模型組和BMSC治療組都可看到氣腫樣改變，BMSC治療組與肺氣腫模型組比較肺組織平均內(nèi)襯間隔（MLI）降低，單位面積平均肺泡數(shù)（MAN）增加（P＜0.05）。結(jié)論BMSC可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎細(xì)胞的增殖及趨化來(lái)干預(yù)IL-17、IL-6表達(dá)，以及促進(jìn)受損肺組織的修復(fù)，來(lái)發(fā)揮對(duì)COPD的干預(yù)作用。

慢性阻塞性肺疾病；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；白介素-17；白介素-6

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）的發(fā)病與氣道慢性炎癥及自身免疫異常有關(guān)，患者體內(nèi)及氣道局部存在大量炎細(xì)胞和炎性介質(zhì)，如白介素（interleukin，IL）-17、IL-6。IL-17誘導(dǎo)多種趨化因子的分泌，引起氣道和肺組織的損傷。IL-6促進(jìn)中性粒細(xì)胞氧化和誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌抗體，延遲炎細(xì)胞凋亡，加重氣道炎癥反應(yīng)。研究［1］表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSC）可以通過(guò)全骨髓貼壁法獲得，且經(jīng)此方法獲得的細(xì)胞穩(wěn)定性和活力佳，分化潛能與安全性良好。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)將BMSC經(jīng)尾靜脈注入大鼠肺氣腫模型體內(nèi)，觀察BMSC對(duì)肺氣腫模型肺組織的修復(fù)以及對(duì)炎癥因子IL-17、IL-6的調(diào)節(jié)作用，初步探討B(tài)MSC對(duì)COPD的干預(yù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑SPF級(jí)健康雄性SD大鼠33只，含3只體重80～100 g的幼鼠，余大鼠體重180～220 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；豬胰蛋白酶（porcine pancreatic elastase，PPE）購(gòu)自美國(guó)羅氏公司；胰酶、胎牛血清、L-DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；大鼠IL-6、IL-17酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D公司。

1.2 BMSC的采集、分離與培養(yǎng)選擇3只4周體重80～100 g的雄性SD大鼠，脫臼處死后，75%乙醇溶液浸泡10 min后，于超凈工作臺(tái)無(wú)菌分離雙側(cè)股骨，剪去包括骺板在內(nèi)的兩側(cè)骺端，用DMEM液反復(fù)沖洗骨髓腔，收集骨髓。將獲得的骨髓細(xì)胞懸浮液移入離心管，2 000 r／min離心10 min，棄上清液，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液（10%FBS，100 U／ml青霉素，100 U／ml鏈霉素）重懸，接種于25 cm2的塑料培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h半量換液一次，去除未貼壁細(xì)胞，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)特征。以后每3 d換液一次。當(dāng)細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底約80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶37℃消化3 min，待細(xì)胞形態(tài)由梭形變?yōu)閳A形后，停止消化，按1∶2傳代培養(yǎng)。

1.3 大鼠肺氣腫模型的制備、實(shí)驗(yàn)分組及處理30只雄性健康SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組、肺氣腫模型組、BMSC治療組，每組各10只。將肺氣腫模型組和BMSC治療組大鼠分別稱(chēng)體重后，用體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛（300 mg／kg）腹腔內(nèi)注射麻醉后，將大鼠固定于操作臺(tái)上，常規(guī)消毒，縱向切開(kāi)頸部皮膚，鈍性分離皮下組織及胸骨舌骨肌，暴露氣管，4號(hào)針頭刺入氣管內(nèi)一次性滴入配制的PPE生理鹽水溶液1 U／g，并注入少量空氣保證試劑或生理鹽水全部進(jìn)入氣管，縫合皮膚，切口消毒，然后直立旋轉(zhuǎn)大鼠，并按摩雙側(cè)胸部，使試劑均勻分布于雙側(cè)肺。正常對(duì)照組依同樣方法注入等體重比量的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）。將鼠放入獨(dú)立盒中，注意保溫，等清醒后放入原盒中，以普通飼料喂養(yǎng)12周后。待大鼠肺氣腫模型成功后，BMSC治療組大鼠經(jīng)尾靜脈注入濃度為1×106個(gè)／ml的第3代BMSC 1 ml，正常對(duì)照組及肺氣腫模型組給予等量PBS處理，各組繼續(xù)飼養(yǎng)2周后處死所有大鼠。

1.4 肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）細(xì)胞計(jì)數(shù)及IL-17、IL-6水平檢測(cè)大鼠稱(chēng)重、腹腔麻醉后固定，無(wú)菌條件腹主動(dòng)脈取血，標(biāo)本室溫下靜止2 h后，3 000 r／min離心5 min，收集血清，分裝儲(chǔ)存于－80℃?zhèn)溆谩１┞稓夤芎头伍T(mén)，于右主支管處結(jié)扎右肺，生理鹽水2 ml×3次行左肺肺泡灌洗，回收的BALF存入硅塑管內(nèi)，以1 500 r／min離心10 min，取上清液凍存－80℃?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)收集細(xì)胞并計(jì)算中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞百分率。按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清和BALF中IL-17、IL-6的濃度。

1.5 肺組織標(biāo)本的留取肺泡灌洗完畢后棄左肺，切取右側(cè)肺組織，置于4℃PBS中洗去血液。所有大鼠取右肺組織浸入10%福爾馬林液中固定24 h，制備蠟塊。

1.6 肺組織病理學(xué)觀察各組大鼠肺組織切片行HE染色作常規(guī)病理學(xué)檢查。每例標(biāo)本選2張切片，每切片隨機(jī)取上、下、左、右、中5個(gè)視野，測(cè)量時(shí)盡量避開(kāi)支氣管及大、中血管。觀察肺平均內(nèi)襯間隔（mean linear intercept，MLI）和單位面積平均肺泡數(shù)（mean alveolar numbers，MAN）。每只大鼠檢測(cè)10個(gè)區(qū)域。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用方差分析及SNK檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 BMSC的培養(yǎng)原代培養(yǎng)24 h后，可見(jiàn)少量貼壁細(xì)胞，細(xì)胞大小及形態(tài)不均一，呈圓形或內(nèi)皮細(xì)胞樣；培養(yǎng)48 h半量換液，去除未貼壁的細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞開(kāi)始融合，在集落中心密集，且集落間出現(xiàn)重疊，見(jiàn)圖1A；約7 d細(xì)胞融合達(dá)80%以上，傳代后細(xì)胞呈均勻分布的長(zhǎng)梭形生長(zhǎng)，平行或螺旋狀排列，見(jiàn)圖1B。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)全骨髓貼壁法獲得BMSC。

圖1 體外培養(yǎng)BMSC的形態(tài)學(xué)觀察 ×200

2.2 血清和BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)肺氣腫模型組、BMSC治療組血清和BALF中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞百分比顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。BMSC治療組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞百分比均低于肺氣肺模型組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.3 血清及BALF中IL-17、IL-6水平ELISA結(jié)果顯示：肺氣腫模型組與正常對(duì)照組比較，BALF和血清中IL-17、IL-6水平均明顯升高（P＜0.01）；且BMSC治療組與肺氣腫模型組比較，BALF中IL-17、IL-6水平均下降（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表1 3組大鼠BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)（n＝10，±s）

表1 3組大鼠BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)（n＝10，±s）

與正常對(duì)照組比較：**P＜0.01；與肺氣腫模型組比較：ΔP＜0.05

組別白細(xì)胞總數(shù)（×109／L）中性粒細(xì)胞百分比（%）淋巴細(xì)胞百分比（%）正常對(duì)照2.41±0.687.96±3.76.42±1.45肺氣腫模型5.33±0.57**24.01±4.91**12.50±2.39**BMSC治療3.73±0.77Δ15.32±2.27Δ8.23±1.54Δ

表2 3組大鼠BALF和血清中的IL-17和IL-6水平（ng／L，n＝10，±s）

表2 3組大鼠BALF和血清中的IL-17和IL-6水平（ng／L，n＝10，±s）

與正常對(duì)照組比較：**P＜0.01；與肺氣腫模型組比較：ΔP＜0.05

組別血清BALF IL-17IL-6 IL-17IL-6正常對(duì)照41.31±3.1211.64±0.8954.61±4.1215.89±1.52肺氣腫模型60.50±5.24**23.22±1.42**72.42±4.48**32.12±2.23**BMSC治療50.60±3.62Δ17.24±3.04Δ60.83±3.76Δ24.14±3.42Δ

2.4 大鼠肺組織病理學(xué)結(jié)果正常對(duì)照組大鼠肺組織肉眼觀表面光滑淡紅色，質(zhì)地較軟，且富有彈性，指壓無(wú)痕，鏡下見(jiàn)肺組織均勻一致。肺氣腫模型組大鼠肺臟肉眼見(jiàn)肺組織體積增大表面有囊泡狀突起，色澤蒼白，質(zhì)地較硬且彈性差，指壓后見(jiàn)壓痕，切面可見(jiàn)肺組織形態(tài)大小不均一。HE染色結(jié)果顯示：除正常對(duì)照組以外，肺氣腫模型組和BMSC治療組的肺組織均出現(xiàn)肺泡壁不同程度的變薄，部分?jǐn)嗔眩闻萸粩U(kuò)大。BMSC治療組較肺氣腫模型組肺氣腫明顯減輕，見(jiàn)圖2。單位面積內(nèi)，肺氣腫模型組和BMSC治療組的MAN小于正常對(duì)照組，而MLI大于正常對(duì)照組（P＜0.05）；BMSC治療組與肺氣腫模型組相比，MAN大于肺氣腫模型組，MLI小于肺氣腫模型組（P＜0.05），見(jiàn)表3。

圖2 大鼠肺組織病理學(xué)結(jié)果×200

表3 3組大鼠肺組織病理學(xué)比較（n＝10，±s）

表3 3組大鼠肺組織病理學(xué)比較（n＝10，±s）

與正常對(duì)照組比較：*P＜0.05；與肺氣腫模型組比較：ΔP＜0.05

組別MLI（μm）MAN（個(gè)／102mm）正常對(duì)照40.38±3.144.73±1.01肺氣腫模型50.88±2.34*2.28±0.89*BMSC治療45.63±1.60Δ3.90±0.62Δ

3 討論

COPD的發(fā)病與機(jī)體肺組織接觸有害氣體和微小顆粒引起的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。吸煙是COPD主要的危險(xiǎn)因素，但也只有20%～30%的吸煙者最終發(fā)展為COPD［2］，這些人共同的特點(diǎn)是具有嚴(yán)重的氣道炎性反應(yīng)，最重要的是在停止吸煙的情況下，這種炎癥反應(yīng)不會(huì)因此停止。Agusti et al［3］首先提出COPD存在自身免疫應(yīng)答假說(shuō)。目前認(rèn)為，COPD是由T淋巴細(xì)胞參與的慢性炎癥反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)所引起的疾病。

IL-17是由T淋巴細(xì)胞及多種細(xì)胞分泌的一類(lèi)炎性介質(zhì)。研究［4－5］表明，COPD患者呼吸道IL-17A／F的表達(dá)是上調(diào)的，且IL-17A基因缺失將會(huì)降低香煙煙霧引起的炎癥和肺泡Ⅱ型細(xì)胞凋亡。IL-17誘導(dǎo)呼吸道上皮細(xì)胞分泌中性粒細(xì)胞趨化因子IL-8，增強(qiáng)ICAM-1表達(dá)促進(jìn)炎細(xì)胞的活化及黏附，使支氣管上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，黏液分泌亢進(jìn)，纖毛運(yùn)動(dòng)減退，炎癥反復(fù)發(fā)作遷延不愈。另外，IL-17誘導(dǎo)中性粒細(xì)和肺泡巨噬細(xì)胞釋放彈性蛋白酶，造成肺泡壁的斷裂，肺大泡形成。本實(shí)驗(yàn)中肺氣腫模型組血清與BALF中IL-17濃度較正常對(duì)照組明顯增高，BMSC干預(yù)后IL-17水平的降低，表明IL-17與COPD形成過(guò)程有著密切聯(lián)系。

IL-6是由淋巴細(xì)胞、單核／巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的炎性介質(zhì)。IL-6水平升高是COPD急性加重期的一個(gè)重要特征［6－7］，與小氣道的炎癥嚴(yán)重程度有關(guān)，且IL-6降低肺功能［8］。IL-6促進(jìn)B細(xì)胞的分化及分泌抗體，使中性粒細(xì)胞氧化延緩凋亡，增加炎細(xì)胞的黏附作用及細(xì)胞外蛋白酶的活性。本研究結(jié)果顯示，肺氣腫模型組血清及BALF中IL-6的顯著增高，與以往的研究相同，表明IL-6與COPD發(fā)生發(fā)展有相關(guān)性。

研究［1］表明通過(guò)全骨髓貼壁法可以獲得BMSC。Weiss et al［9］對(duì)接受BMSC治療的COPD患者進(jìn)行為期2年的隨訪(fǎng)，結(jié)果顯示BMSC對(duì)COPD的治療具有安全性。BMSC分化為氣道上皮細(xì)胞和肺泡Ⅱ型細(xì)胞修復(fù)受損的肺組織，分泌各類(lèi)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)細(xì)胞增生，增加肺小動(dòng)脈的數(shù)量，緩解肺動(dòng)脈高壓和減輕肺血管的重塑［10］；BMSC作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，減輕肺局部異常免疫反應(yīng)，從而為損傷肺組織的修復(fù)提供有利環(huán)境。體外實(shí)驗(yàn)［11－12］表明，BMSC和T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，可抑制淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞的增殖，降低其分泌的炎性介質(zhì)水平，從而減輕局部的炎癥反應(yīng)。

研究［13］表明，用熏煙和注射胰蛋白酶兩種方法誘導(dǎo)的肺氣腫模型病理學(xué)特點(diǎn)和血液中的IL-17無(wú)明顯差異。本研究通過(guò)氣管內(nèi)注入PPE誘導(dǎo)COPD模型，病理學(xué)觀察肺氣腫模型組和BMSC治療組肺組織均出現(xiàn)肺泡壁變薄，部分?jǐn)嗔眩闻萸粩U(kuò)大。肺氣腫模型組BALF中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞百分比均有不同程度增高，表明中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞在COPD患者氣道及肺泡局部聚集。肺氣腫模型組血液和BALF中的IL-17、IL-6較正常組對(duì)照組明顯升高，經(jīng)BMSC干預(yù)后降低，表明BMSC可能是通過(guò)抑制淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞產(chǎn)生IL-17、IL-6，從而抑制COPD的慢性炎癥反應(yīng)。本研究顯示，BMSC干預(yù)后MAN較肺氣腫模型組增大，MLI減小，表明BMSC對(duì)肺小葉有修復(fù)作用。但這種對(duì)肺小葉的修復(fù)機(jī)制是通過(guò)抑制局部炎性反應(yīng)，還是通過(guò)BMSC的定向分化為肺泡上皮產(chǎn)生，亦或兩者的協(xié)同作用，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。而B(niǎo)MSC對(duì)COPD的進(jìn)展發(fā)揮了明顯的干預(yù)作用卻是顯而易見(jiàn)的。

綜上所述，由于肺組織的特殊結(jié)構(gòu)促使BMSC能夠高比例的定植于受損的肺組織，BMSC對(duì)COPD的治療作用可能是通過(guò)抑制炎性細(xì)胞的增殖分化，調(diào)節(jié)炎細(xì)胞和炎癥介質(zhì)水平來(lái)減少肺組織的損害。這將為臨床探索治療COPD的新方法提供重要參考。

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Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on cytokines of IL-17，IL-6 in rat model of emphysema

Wang Liyan，Wu Qian，Wang Yefang，et al
（Dept of Geriatric Pulmonary Medicine，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo explore the mechanism of MSC treatment for COPD by studying the effect of bone marrow mesenchymal stem cells on IL-6 and IL-17 in BALF and serum of emphysema model，as well as lung pathological changes.MethodsThirty healthy male SD rats were randomly divided into 3 groups，normal control group，emphysema model group，BMSC treatment group.After establishing rat models of COPD through endotracheal injection which induced in porcine trypsin，biological treatment was given by injecting BMSC via rat caudal vein.All rats were executed two weeks later，observing the pathological changes of lung tissues and the total number of white blood cells，the percentage of neutrophils and lymphocytes in BALF and serum.Using the ELISA method to detect the level of IL-17 and IL-6 in serum and BALF.ResultsCompared with normal control group，the WBC total number，percentage of neutrophil and lymphocyte increased in BALF of emphysema model group and BMSC treatment group（P＜0.05），and BMSC treatment group was significantly lower than that in emphysema model group（P ＜0.05）；ELISA results showed that the level of IL-17，IL-6 in serum and BALF of emphysema model group and BMSC treatment group was significantly higher than normal control group，BMSC treatment group was lower than that in emphysema model group（P＜0.05）.Emphysema-like changes could be seen in emphysema model group and BMSC treatment，compared with emphysema model group the average lung tissue lining interval（MLI）in BMSC treatment group was decreased，while the mean alveolar number（MAN）per unit area was increased，and thedifference was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionBone marrow mesenchymal stem cells may have intervention effect on COPD，by regulating inflammation cell proliferation and chemotaxis to intervene the expression of IL-17 and IL-6，as well as promote the the damaged lung tissue to repair.

chronic obstructive pulmonary disease；bone marrow derived mesenchymal stem cell；IL-17；IL-6

R 563.3；R 392.4；R 392.114

1000－1492（2014）05－0572－05

2014－03－25接收

安徽省教育廳自然科學(xué)基金（編號(hào)：KJ2009A118）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年呼吸內(nèi)科，合肥 230022

王麗雁，女，碩士研究生；

汪偉民，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wangwm7＠tom.com