腦源性神經營養因子緩釋膠原凝膠支架對神經干細胞生長和分化的影響

黃 斐，馬廣文，尹宗生，王 清，尹 勇

腦源性神經營養因子緩釋膠原凝膠支架對神經干細胞生長和分化的影響

黃 斐1，馬廣文1，尹宗生2，王 清1，尹 勇1

目的觀察腦源性神經營養因子（BDNF）緩釋膠原凝膠支架對神經干細胞生長和分化的影響。方法將BDNF與膠原凝膠溶液混合，制備成BDNF緩釋支架，采用ELISA法檢測緩釋支架中BDNF的釋放曲線，然后將大鼠胚胎神經干細胞接種于緩釋支架中作為實驗組，并觀察神經干細胞在緩釋支架中的生長情況。以常規添加BDNF并懸浮培養的神經干細胞作為對照組，采用免疫熒光方法鑒定緩釋支架中神經干細胞分化成不同神經細胞的比例，并用細胞活力檢測試劑盒（CCK-8）檢測不同培養組中神經干細胞的活力。結果ELISA結果顯示緩釋支架可以持續釋放BDNF達到10 d，體外實驗顯示該緩釋支架與神經干細胞有較好的生物相容性，CCK-8檢測顯示緩釋支架中神經干細胞活力優于對照組（P＜0.05），免疫熒光證實緩釋支架中神經干細胞分化成神經元的比例要高于對照組（P＜0.05）。結論BDNF緩釋膠原凝膠支架具有良好的生物相容性，可以促進神經干細胞生存并誘導其分化成神經元。

神經干細胞；膠原凝膠；神經球；胚胎；大鼠

神經干細胞具有增殖、自我更新和多向分化能力［1］，是目前常用的種子細胞。研究［2－3］表明移植外源性神經干細胞治療中樞神經系統疾病可以促進其功能恢復，但是為了達到治療效果，就需要在體外培養足夠數量的細胞，并誘導神經干細胞主要向神經元分化。研究［4－6］顯示神經干細胞的生存、增殖和分化都受到神經營養因子的調控。腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是目前研究較多的一種神經營養因子，它可以促進神經干細胞生存，并誘導神經干細胞向γ-氨基丁酸（Gamma-amino butyric acid，GABA）能神經元分化［7］，因此在神經干細胞培養時常加入BDNF進行誘導分化。然而有研究［8］顯示神經營養因子加入到培養液后很快就失活，只有少部分的神經營養因子能與細胞相互作用，為了解決這個問題，該研究利用膠原凝膠與BDNF相互混合構建BDNF緩釋膠原凝膠支架，并觀察緩釋支架對BDNF生物活性的保護作用，以及對神經干細胞生長和分化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物孕14 d的SD大鼠3只，雌性，清潔級，300～320 g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器DMEM／F12培養基、B27和胎牛血清（美國Gibco公司）；表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，b-FGF）（美國Pepro-Tech公司）；Ⅰ型鼠尾膠原、accutase酶和DAPI（美國Sigma公司）；一抗兔抗大鼠Nestin多克隆抗體（英國Abcam公司）；小鼠抗大鼠βⅢ-tubulin單克隆抗體、兔抗大鼠GFAP多克隆抗體和小鼠抗大鼠CNPase單克隆抗體（美國Chemicon公司）；熒光二抗（美國Jackson公司）；細胞活力檢測試劑盒（CCK-8，日本Dojindo公司）；BX-51免疫熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 神經干細胞的分離培養將SD大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后，用75%乙醇溶液浸泡5 min，無菌條件下取出胎鼠大腦皮質放入預冷的DMEM／F12培養液中，用眼科剪將組織塊剪成1 mm×1 mm ×1 mm大小，用吸管反復吹打后取上清液，通過200目濾網過濾制成單細胞懸液，收集單細胞懸液800 r／min離心10 min，棄上清，加入含有2%B27、20 ng／ml EGF和b-FGF的DMEM／F12培養液重懸細胞，調節細胞密度為2×105／ml接種到50 ml培養瓶中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。

1.4 神經干細胞的傳代培養培養5～7 d后將神經干細胞收集到離心管中，800 r／min離心5 min后，棄上清液加入0.5 ml accutase酶，37℃孵育10 min后，加入等量培養液終止消化，用經火焰拋光的吸管吹打制成單細胞懸液，800 r／min離心5 min后，棄上清液定量加入培養液，調整細胞密度為2× 105／ml接種到50 ml培養瓶中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱培養。以后每2～3 d進行半量換液，每6～7 d傳代1次

1.5 構建BDNF凝膠緩釋支架無菌條件下用三蒸水將BDNF溶解成100 μg／ml，將Ⅰ型膠原蛋白用三蒸水溶解成0.5 mg／ml，取40 ng BDNF與200 μl膠原凝膠混合后，平鋪于細胞爬片上，然后在無菌條件下4℃風干保存。

1.6 BDNF緩釋凝膠支架體外釋放檢測BDNF

體外釋放實驗可采取雙抗夾心ELISA法測定。神經干細胞接種于緩釋支架中作為實驗組，在神經干細胞與緩釋支架混合培養后6、12 h，1、3、5、7、10 d分別取細胞培養液100 μl，按ELISA試劑盒說明進行檢測，用酶標儀于450 nm處測出液體中BDNF吸光度，以吸光度間接反應BDNF濃度，繪制出BDNF釋放曲線。以常規添加相同數量的BDNF并懸浮培養的神經干細胞作為對照組，并在相同時間點檢測BDNF濃度。所有實驗均重復3次，取平均值。

1.7 細胞活力檢測采用CCK-8檢測神經干細胞與緩釋支架共培養時的活力。采用96孔細胞培養板檢測，具體操作方法按照CCK-8說明書進行，神經干細胞密度為5×104／ml，每組共有5個培養孔，每孔加入100 μl，在培養1、4、7 d后，每孔加入10 μl CCK-8在37℃、5%CO2條件下培養4 h，用酶標儀測定450 nm，參考波長為650 nm的吸光度值（A）。

1.8 緩釋凝膠支架對神經干細胞分化潛能的影響的測定神經干細胞與緩釋凝膠支架共培養1周后，免疫熒光方法檢測共培養的神經干細胞分化潛能。細胞用預冷的4%多聚甲醛室溫固定20 min，再用含有5%正常山羊血清和0.3%Triton X-100的PBS濕盒內室溫封閉通透1 h后，加入一抗神經干細胞標志物Nestin（1∶250）、神經元標志物βⅢ-tubulin（1∶100）、神經膠質細胞標志物GFAP （1∶400）、少突膠質細胞標志物CNPase（1∶200），4℃孵育過夜后，加入相應熒光二抗室溫孵育1 h，加入DAPI復染細胞核，各步驟之間PBS洗3次，在免疫熒光顯微鏡下觀察。測定神經干細胞分化潛能時，隨機選取20個視野，以DAPI染色的細胞核數為總細胞數，分別計數βⅢ-tubulin、GFAP和CNPase陽性細胞數來計算神經元、神經膠質細胞和少突膠質細胞的分化比例。對照組每天在培養液中加入40 ng BDNF培養1周后，去除EGF和b-FGF誘導神經球貼壁，同樣用免疫熒光方法鑒定其分化潛能。

1.9 統計學處理采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，數據以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 神經干細胞的懸浮培養和鑒定分離的細胞在無血清并含有EGF、b-FGF的培養液中懸浮生長形成神經球，懸浮生長4～5 d的神經球傳代后，可以形成新的神經球。收集神經球制成單細胞懸液，在1%胎牛血清的誘導下，神經球來源的細胞貼壁分化形成神經細胞。免疫熒光顯示神經球表達神經干細胞標志物Nestin。因此懸浮神經球可以認為是神經干細胞，見圖1。

圖1 神經干細胞培養與鑒定

2.2 緩釋支架材料上BDNF的釋放曲線BDNF在最初的24 h內累計釋放量為61.1%，表現為釋放曲線的急劇上升，顯示BDNF為爆發性釋放，而2 d后釋放曲線緩慢上抬，7 d時累計釋放量達到89.9%，表現為BDNF的持續緩慢釋放。在任何時間點對照組BDNF都未能檢測出，兩組之間在不同實驗時間段的釋放率差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 BDNF的釋放曲線

2.3 神經干細胞與緩釋支架共培養將神經干細胞按1×105／ml種入0.5 mg／ml的膠原凝膠緩釋支架中進行共培養，由于這些細胞來源單一，光鏡下觀察細胞折光性強，細胞活力較好，培養7 d后緩釋支架中的細胞增殖形成神經球，見圖3。

圖3 神經干細胞在與緩釋支架共培養

2.4 細胞活力檢測用CCK-8來檢測細胞活力，培養1 d時，實驗組與對照組細胞活力比較差異無統計學意義（P＞0.05）。培養4 d時，隨著BDNF的持續釋放，實驗組細胞活力要高于對照組（P＜0.05），而培養7 d時隨著緩釋支架中BDNF釋放的減少，實驗組與對照組比較細胞活力差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 CCK-8檢測不同培養組中神經干細胞的活力

2.5 緩釋支架對神經干細胞分化的影響將膠原凝膠三維培養1周后的神經干細胞用1%胎牛血清誘導分化5 d后，免疫熒光顯示實驗組神經干細胞分化為βⅢ-tubulin陽性率為（38.26±1.56）%、GFAP陽性率為（48.62±4.78）%、CNPase陽性率為（15.47±1.32）%，而對照組中的神經干細胞分化為βⅢ-tubulin陽性率為（18.29±1.86）%、GFAP陽性率為（71.27±4.22）%、CNPase陽性率為（11.32±1.43）%，見圖5。兩組間分化成神經元和神經膠質細胞的比例比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖5 免疫雙標顯示不同培養組中神經干細胞分化成神經細胞 ×400

3 討論

目前對中樞神經系統損傷缺乏有效的治療手段，神經干細胞因為具有分化成神經細胞的潛能而受到廣泛研究。神經營養因子在神經干細胞的生存、增殖和分化中都起到了重要的調控作用。BDNF目前研究較為廣泛，該研究表明BDNF可以通過酪氨酸激酶B（TrKB）受體促進神經干細胞增殖，并誘導神經干細胞向神經元和少突膠質細胞分化。然而BDNF在培養液中半衰期很短，只有少量的BDNF與細胞發生作用，因此在本實驗中構建BDNF-膠原凝膠緩釋支架載體，來維持BDNF的活性，促進BDNF與神經干細胞發生作用，維持神經干細胞的生長并誘導分化。

膠原凝膠是水凝膠的一種，擁有水凝膠的特點，可以形成立體三維網狀支架，同時膠原蛋白作為天然的細胞外基質，具有無毒性、低免疫原性和可降解性等優點［9-11］。有研究［12］表明神經干細胞可以在膠原凝膠支架中增殖并傳代，同時膠原凝膠支架可以維持神經干細胞的干細胞特性，而對神經干細胞的分化無明顯影響。一些學者也將膠原凝膠支架作為緩釋載體進行研究，Bhang et al［13］研究發現利用膠原凝膠支架和神經營養因子-3構建的緩釋系統可以極大的減少PC-12細胞培養所需的生長因子數量，而且膠原凝膠支架可以維持神經營養因子-3的活性，延長它的作用時間。

本實驗顯示膠原凝膠中BDNF的釋放符合雙相動力學釋藥規律，既有初期的快速釋放，也有后期的緩釋，這種釋放特點可以在局部形成有效濃度，有助于神經干細胞的生長和分化。CCK-8檢測顯示BDNF-膠原凝膠實驗組中的神經干細胞活力要高于在對照組中神經干細胞活力，同時免疫熒光結果顯示實驗組神經干細胞分化成神經元的比例也高于對照組。

本研究表明BDNF復合于膠原凝膠中，可以達到緩釋的目的，構建了帶有生長因子緩釋效果的生物支架，該支架能夠很好的促進神經干細胞的生長并提高神經干細胞向神經元分化的比例，為后期進一步的體內實驗奠定了基礎。

［1］Chojnacki A，Weiss S.Production of neurons，astrocytes and oligodendrocytes from mammalian CNS stem cells［J］.Nat Protoc，2008，3（6）：935－40.

［2］Sandner B，Prang P，Rivera F J，et al.Neural stem cells for spinal cord repair［J］.Cell Tissue Res，2012，349（1）：349－62.

［3］Goldman S.Stem and progenitor cell-based therapy of the human central nervous system［J］.Nat Biotechnol，2005，23（7）：862－71.

［4］Choi K C，Yoo D S，Cho K S，et al.Effect of single growth factor and growth factor combinations on differentiation of neural stem cells［J］.J Korean Neurosurg Soc，2008，44（6）：375－81.

［5］Oh J，McCloskey M A，Blong C C，et al.Astrocyte-derived interleukin-6 promotes specific neuronal differentiation of neural progenitor cells from adult hippocampus［J］.J Neurosci Res，2010，88（13）：2798－809.

［6］Johansson S，Price J，Modo M.Effect of inflammatory cytokines on major histocompatibility complex expression and differentiation of human neural stem／progenitor cells［J］.Stem Cells，2008，26 （9）：244－54.

［7］Elliott R C，Black I B，Dregfus C F.Differential regulation of p75 and trkB mRNA expression after depolarizing stimuli or BDNF treatment in basal forebrain neuron cultures［J］.J Neurosci Res，2001，66（1）：83－8.

［8］Schuss Z，Singer A，Holcman D.The narrow escape problem for diffusion in cellular microdomains［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（44）：16098－103.

［9］Watanabe K，Nakamura M，Okano H，et al.Establishment of three-dimensional culture of neural stem／progenitor cells in collagen type-1 Gel［J］.Restor Neurol Neurosci，2007，25（2）：109 －17.

［10］Ma W，Fitzgerald W，Liu Q Y，et al.CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels［J］.Exp Neurol，2004，190（2）：276－88.

［11］Yang Z，Mo L，Duan H，et al.Effects of chitosan／collagen substrates on the behavior of rat neural stem cells［J］.Sci China Life Sci，2010，53（2）：215－22.

［12］Huang F，Shen Q，Zhao J T.Growth and differentiation of neural stem cells in a three-dimensional collagen gel scaffold［J］.Neural Regener Res，2013，8（4）：313－9.

［13］Bhang S H，Lee T J，Lim J M，et al.The effect of the controlled release of nerve growth factor from collagen gel on the efficiency of neural cell culture［J］.Biomaterials，2009，30（1）：126－32.

Effects of slow-release of brain-derived neurotrophic factor from collagen gel on growth and differentiation of neural stem cells

Huang Fei1，Ma Guangwen1，Yin Zongsheng2，et al
（1Dept of Orthopaedics，The Fourth Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of Orthopaedics，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo observe the effects of the slow-release of brain-derived neurotrophic factor（BDNF）from collagen gel on growth and differentiation of neural stem cells.MethodsBDNF was mixed with collagen gel to prepare BDNF-collagen gel slow-release scaffold.The quantity and duration of BDNF release from the scaffold were determined by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.The embryonic rat neural stem cells were seeded in BDNF-collagen gel slow-release scaffold，and to observe the survival of neural stem cells.With group of daily add-ition of BDNF as a control，the proportion of differentiated cells of neural stem cells in BDNF-collagen gel slow-release scaffold were identified by the immunofluorescence techniques.The cell viability of neural stem cells cultured in different groups was detected by Cell Counting Kit-8（CCK-8）assay.ResultsThe ELISA showed BDNF was released from collagen gel for at least 10 days in vitro.The study showed that the slow-release scaffold and neural stem cells had a good biocompatibility in vitro，and neural stem cells could survive in slow-release scaffold.The CCK-8 testing showed the neural stem cells in BDNF-collagen gel slow-release scaffold group had higher cell viabilities than those in the control group（P＜0.05）.Immunofluorescence showed the differentiation percentage from neural stem cells into neurons in the BDNF-collagen gel slow-release scaffold group was higher than those in the control group（P＜0.05）.ConclusionBDNF-collagen gel slow-release scaffold，with a good biocompatibility，can enhance survival of neural stem cells，and induce them to differentiate into neurons.

neural stem cells；collagen gel；neurosphere；embryo；rat

R 394.2

1000－1492（2014）05－0586－05

2013－12－20接收

安徽醫科大學校基金（編號：2013xkj045）

1安徽醫科大學第四附屬醫院骨科，合肥 230022

2安徽醫科大學第一附屬醫院骨科，合肥 230022

黃 斐，男，醫師；

馬廣文，男，主任醫師，責任作者，E-mail：hbmagw＠126.com