條件培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)研究

宋旆文，徐 鵬，尤 濤，董福龍，章仁杰，申才良

條件培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)研究

宋旆文，徐 鵬，尤 濤，董福龍，章仁杰，申才良

目的觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）條件培養(yǎng)基對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）分化的影響。方法提取第3代大鼠BMSCs條件培養(yǎng)基，濃縮后加到NSCs培養(yǎng)基中，對(duì)所培養(yǎng)的NSCs進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和免疫化學(xué)染色法鑒定。結(jié)果在加入大鼠BMSCs條件培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)組，24 h內(nèi)見(jiàn)懸浮生長(zhǎng)的NSCs球開始貼壁生長(zhǎng)。至第3天，所有懸浮細(xì)胞球基本貼壁生長(zhǎng)，大量細(xì)胞從中爬出，伸出突起。第7天時(shí)，伸出細(xì)胞交織成網(wǎng)。對(duì)貼壁分化后的NSCs進(jìn)行免疫化學(xué)染色，其表達(dá)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的特異性蛋白。而未加入條件培養(yǎng)基的對(duì)照組，NSCs仍呈懸浮生長(zhǎng)，未見(jiàn)大量細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)及分化。結(jié)論在完全去除BMSCs細(xì)胞的情況下，含有大鼠BMSCs分泌的細(xì)胞因子的條件培養(yǎng)基對(duì)NSCs的貼壁分化有顯著的促進(jìn)作用。

間充質(zhì)干細(xì)胞；神經(jīng)干細(xì)胞；分化；條件培養(yǎng)基

神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）是來(lái)源于神經(jīng)組織的未成熟細(xì)胞，能夠在體內(nèi)分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，替代原來(lái)受損的神經(jīng)細(xì)胞，從而促進(jìn)脊髓損傷后功能的恢復(fù)［1］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）則屬于成體干細(xì)胞的一種，具有多向分化的潛能，在特定的條件下能夠分化成為成骨、脂肪、神經(jīng)、內(nèi)皮祖細(xì)胞等。在大量細(xì)胞移植治療脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究中，BMSCs因具有的抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)軸突和血管再生等而被廣泛應(yīng)用［2］。然而，BMSCs 的移植也有著許多不利的方面，如移植后在宿主體內(nèi)無(wú)法長(zhǎng)期存活、分化的不確定性和局限性以及其他潛在風(fēng)險(xiǎn)［3］。BMSCs可以分泌各種細(xì)胞因子，直接利用含BMSCs所分泌的各種細(xì)胞因子的條件培養(yǎng)基對(duì)于許多疾病的治療取得了積極的療效［4－5］。因此，利用BMSCs條件培養(yǎng)基，在體外實(shí)驗(yàn)中研究其對(duì)于NSCs分化的影響，從而探討在完全去除BMSCs細(xì)胞的情況下，BMSCs分泌的細(xì)胞因子對(duì)NSCs的作用，也為脊髓損傷的細(xì)胞治療提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 4～6周SD大鼠1只，清潔級(jí)，100～120 g；24 h內(nèi)新生SD大鼠幼鼠，均由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 試劑 DMEM-LG、DMEM-HG購(gòu)自美國(guó)Hy-Clone公司；DMEM／F12培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；B-27添加劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司；PE標(biāo)記的抗大鼠CD29、CD90及FITC標(biāo)記的抗大鼠CD34、CD44抗體購(gòu)自美國(guó)BioLegend公司；小鼠抗大鼠巢蛋白（nestin）單克隆抗體、兔抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、小鼠抗微管相關(guān)蛋白2（microtubule-associatedprotein-2，MAP-2）抗體、FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG、Triton X-100購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；多聚賴氨酸、地塞米松、β-甘油酸鈉、抗壞血酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；即用型正常山羊血清購(gòu)自武漢博士德公司；青鏈霉素溶液（100×）、Hoechst 33342、胰酶細(xì)胞消化液、免疫染色一抗稀釋液、免疫熒光染色二抗稀釋液、免疫染色固定液、抗熒光淬滅封片液（強(qiáng)）購(gòu)自中國(guó)碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠BMSCs的體外分離、培養(yǎng)、鑒定、成骨分化 采用全骨髓貼壁法從大鼠骨髓中分離和培養(yǎng)BMSCs，完全培養(yǎng)基由10%胎牛血清的DMEM＋100 U／ml青／鏈霉素構(gòu)成，將細(xì)胞培養(yǎng)于含37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d更換培養(yǎng)液一次。待細(xì)胞融合達(dá)到80%后，按1∶2傳代培養(yǎng)。

取生長(zhǎng)良好的第3代大鼠BMSCs，用0.25%胰酶預(yù)熱消化后，制成均勻的單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，并調(diào)整細(xì)胞密度約為106個(gè)／管，加入PBS 100 μl。在室溫，避光條件下加入FITC標(biāo)記抗大鼠CD34的單克隆抗體，藻紅蛋白（PE）標(biāo)記抗鼠CD90、CD29的單克隆抗體，溫育30 min后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

取第3代大鼠BMSCs制成單細(xì)胞懸液，按1.5 ×104／cm2接種至6孔板；待細(xì)胞長(zhǎng)至完全融合時(shí)實(shí)驗(yàn)組每孔加入2.5 ml成骨誘導(dǎo)液（高糖DMEM培養(yǎng)液、10%胎牛血清、100 U／ml青／鏈霉素、100 nmol／L地塞米松、5 mmol／L β-甘油酸鈉、50 μg／ml抗壞血酸），對(duì)照組繼續(xù)用原培養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔3 d換液一次，第21天終止誘導(dǎo)，吸去培養(yǎng)液，PBS沖洗2次；95%乙醇固定30 min，蒸餾水沖洗3次，茜素紅染液37℃染色30 min，蒸餾水沖洗3次，顯微鏡下觀察。

1.2.2 大鼠BMSCs條件培養(yǎng)基的獲得 將第3代BMSCs接種于T75培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到90%融合，棄去原培養(yǎng)基，用PBS沖洗3次后，加入無(wú)血清的DMEM／F12培養(yǎng)直至48 h。之后，將收集的條件培養(yǎng)基用10 ku濃縮離心管，在13℃、4 000 r／min離心15 min進(jìn)行濃縮。濃縮后的條件培養(yǎng)基通過(guò)0.22 μm無(wú)菌濾器進(jìn)行過(guò)濾，凍存于－80℃，直至使用時(shí)取出。

1.2.3 大鼠NSCs的體外分離培養(yǎng) 取新生24 h內(nèi)的SD大鼠幼鼠，頸椎脫臼法處死，經(jīng)75%乙醇浸泡5 min。在無(wú)菌條件下斷頭，分離出全腦，剝除腦膜及血塊，切碎腦組織，移入15 ml離心管中，加入1 ml胰酶細(xì)胞消化液置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化10 ～15 min，加入10%胎牛血清培養(yǎng)基終止消化，經(jīng)篩網(wǎng)過(guò)濾制成單細(xì)胞懸液，以600 r／min離心5 min后棄上清液，加入2 ml無(wú)血清培養(yǎng)基（DMEM／F12、2%B-27、EGF 20 ng／ml、bFGF 20 ng／ml、100×青鏈霉素溶液）再次離心，棄上清液，加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，以105個(gè)／ml接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d半量換液1次，5～7 d傳代。

1.2.4 NSCs的鑒定 取第2代培養(yǎng)7 d的NSCs球，接種于經(jīng)0.1 mg／ml多聚賴氨酸包被處理后的蓋玻片的6孔板中，37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜，次日吸去培養(yǎng)基，用0.01 mol／L的PBS洗3次，每次5 min，免疫熒光染色固定液常溫下固定20 min，吸去多余殘液后用0.01 mol／L的PBS洗3次，每次5 min，后在含0.1%Triton X-100的PBS液中孵育20 min，PBS液漂洗3次，每次5 min，加入正常山羊血清工作液后置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，加入一抗nestin抗體（1∶50），4℃條件下孵育過(guò)夜，次日，常溫下放置2 h，后PBS液漂洗3次，每次5 min，后加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（1∶100），37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育1 h，PBS漂洗3次，每次5 min，晾干后，抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡觀察及照相。

1.2.5 NSCs的分化及分化后鑒定 取第2代培養(yǎng)7 d的NSCs，經(jīng)離心后，吸棄舊的無(wú)血清培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基為去除EGF、bFGF的含10%FBS的DMEM／F12中培養(yǎng)。重懸后，接種于放有經(jīng)0.1 mg／ml多聚賴氨酸包被過(guò)夜的蓋玻片的6孔板中，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d減半量換液。

NSCs貼壁培養(yǎng)7 d后，形態(tài)上已出現(xiàn)了明顯的分化，各蓋玻片已大部鋪滿，選取神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物GFAP、MAP-2行免疫熒光染色。用0.01 mol／L的PBS洗3次，每次5 min，免疫熒光染色固定液常溫下固定20 min，吸去多余殘液后用0.01 mol／L的PBS洗3次，每次5 min，后在含0.1%Triton X-100的PBS液中孵育20 min，PBS液漂洗3次，每次5 min，加入正常山羊血清工作液后置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，將一抗MAP-2、GFAP抗體按1∶50混合稀釋后加入各培養(yǎng)孔內(nèi)，4℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜，次日，常溫下放置2 h，PBS液漂洗3次，每次5 min，后加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（1∶100）及TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG （1∶100），37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育2 h，PBS漂洗3次，每次5 min，晾干后，抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡觀察及照相。

1.2.6 大鼠NSCs和BMSCs條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)將1×106細(xì)胞數(shù)的NSCs接種于6孔板中，對(duì)照組直接加入NSCs培養(yǎng)基＋25%DMEM／F12，共培養(yǎng)組加入NSCs培養(yǎng)基＋25%BMSCs濃縮的條件培養(yǎng)基。每日觀察細(xì)胞形態(tài)變化及細(xì)胞貼壁情況，第3天換液一次。第7天終止培養(yǎng)，進(jìn)行免疫化學(xué)染色。

圖2 大鼠BMSCs表面標(biāo)志物檢測(cè)

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的形態(tài)觀察及鑒定原代BMSCs剛接種時(shí)，可見(jiàn)大量細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，24 h首次換液，懸浮細(xì)胞明顯減少，鏡下已可見(jiàn)部分貼壁細(xì)胞，多為圓形，大小不一，不能清晰辨認(rèn)細(xì)胞核。4～5 d可見(jiàn)部分貼壁細(xì)胞呈多角形、梭形，數(shù)量逐漸增多。至第3代以后，細(xì)胞形態(tài)基本均勻一致，呈較典型的放射狀生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1。流式細(xì)胞儀對(duì)第3代大鼠BMSCs細(xì)胞免疫表型檢測(cè)結(jié)果顯示，CD29、CD90陽(yáng)性率分別為0.972和0.983；CD34陽(yáng)性率為0.321，見(jiàn)圖2。同時(shí)對(duì)第3代細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，至誘導(dǎo)3周時(shí)，鏡下可見(jiàn)明顯的鈣結(jié)節(jié)形成，茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)，見(jiàn)圖3。

圖1 BMSCs形態(tài)觀察 ×100

2.2 NSCs的形態(tài)觀察及鑒定原代細(xì)胞接種2～3 d后可見(jiàn)NSCs成球形懸浮生長(zhǎng)，到第7天時(shí)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)出數(shù)十個(gè)甚至上百個(gè)細(xì)胞的集落，多呈球形、桑葚狀，折光性強(qiáng)，未見(jiàn)到明顯的貼壁和細(xì)胞突起形成，見(jiàn)圖3，部分NSCs因體積過(guò)大導(dǎo)致細(xì)胞球中心出現(xiàn)顏色暗淡、透光性較差。將培養(yǎng)7 d貼壁固定的NSCs球行nestin免疫熒光染色，結(jié)果顯示貼壁的細(xì)胞球中大部分細(xì)胞表達(dá)nestin陽(yáng)性，見(jiàn)圖4。

圖3 BMSCs成骨、茜素紅染色和NSCs形態(tài)及鑒定

圖4 NSCs分化后鑒定和加入BMSCs條件培養(yǎng)基后NSCs形態(tài)觀察及鑒定

2.3 NSCs分化后形態(tài)觀察及鑒定在NSCs接種的用多聚賴氨酸處理過(guò)蓋玻片的6孔板中，發(fā)現(xiàn)NSCs球逐漸貼壁，細(xì)胞逐漸從球中爬出，表現(xiàn)出多種形態(tài)，部分細(xì)胞分化為具有多個(gè)突起，胞體圓形、橢圓形的神經(jīng)元樣細(xì)胞。部分則出現(xiàn)粗長(zhǎng)突起并呈梭樣排列的神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞，并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，突起逐漸變長(zhǎng)、增多。免疫熒光染色結(jié)果可見(jiàn)MAP-2陽(yáng)性的神經(jīng)元細(xì)胞及GFAP陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞，見(jiàn)圖4。

2.4 加入BMSCs條件培養(yǎng)基后NSCs形態(tài)的觀察及鑒定實(shí)驗(yàn)組在加入條件培養(yǎng)基24 h內(nèi)，就可見(jiàn)部分NSCs開始貼壁分化。培養(yǎng)第3天可見(jiàn)多種形態(tài)細(xì)胞從貼壁的NSCs球中爬出，伸出突起，至第7天時(shí)，細(xì)胞間膠質(zhì)成網(wǎng)，見(jiàn)圖4。而對(duì)照組細(xì)胞一直呈懸浮球狀生長(zhǎng)。將實(shí)驗(yàn)組貼壁細(xì)胞行免疫熒光染色，GFAP及MAP-2陽(yáng)性，證明貼壁細(xì)胞為NSCs分化的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，見(jiàn)圖4。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，利用MSCs的條件培養(yǎng)基，在含有bFGF和EGF兩種因子的情況下，仍可以促進(jìn)懸浮生長(zhǎng)的NSCs球貼壁分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，表明BMSCs所分泌的各種因子能夠促進(jìn)NSCs的貼壁分化。

在脊髓損傷后，機(jī)體會(huì)自發(fā)的激活內(nèi)源性的NSCs［6］或者通過(guò)外源性NSCs的植入使得局部的NSCs增多，這對(duì)于損傷后功能的恢復(fù)有著重要意義。因此，增加局部NSCs的存活率和促進(jìn)NSCs向具有功能的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞分化尤為重要。既往的實(shí)驗(yàn)利用BMSCs和NSCs的協(xié)同作用，將兩者聯(lián)合移植治療脊髓損傷已取得了一定的成效。但隨著實(shí)驗(yàn)的不斷進(jìn)行，研究人員發(fā)現(xiàn)MSCs所獲得的很多積極效應(yīng)并非依賴于細(xì)胞本身作用，而是通過(guò)分泌各種細(xì)胞因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如腦原性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)生長(zhǎng)因子及其金屬蛋白酶組織抑制劑-1和中性粒細(xì)胞趨化因子-3等，這些營(yíng)養(yǎng)因子不僅可以保護(hù)NSCs移植的凋亡，同時(shí)對(duì)NSCs的增殖和分化也有著重要作用［7－8］。

本研究中，實(shí)驗(yàn)組加入條件培養(yǎng)基后，懸浮的NSCs球即開始貼壁分化，大量細(xì)胞從中爬出，伸出突起，最終交織成網(wǎng)。對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行免疫化學(xué)檢測(cè)，GFAP及MAP-2呈陽(yáng)性，表明NSCs貼壁分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。而對(duì)照組細(xì)胞仍懸浮生長(zhǎng)，且呈球狀生長(zhǎng)，鮮有貼壁。這一結(jié)果與其他許多MSCs 和NSCs共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中所觀察到的NSCs的改變基本相符。如Wang et al［9］將BMSCs和NSCs混合后直接共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)種植后12 h，BMSCs表面貼壁的NSCs球即開始呈放射狀向外遷移。楊早等［10］利用Transwell培養(yǎng)板構(gòu)建的NSCs和MSCs非接觸性共培養(yǎng)體系也是觀察到了對(duì)NSCs促貼壁分化這一現(xiàn)象，這些共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)均表明MSCs具有促進(jìn)NSCs分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的作用，但都沒(méi)有完全去除BMSCs本身。非接觸共培養(yǎng)雖然去除了BMSCs和NSCs的直接接觸，但仍無(wú)法避免NSCs分泌的各種因子通過(guò)共同培養(yǎng)基與BMSCs形成間接接觸，從而影響B(tài)MSCs細(xì)胞因子的分泌。本實(shí)驗(yàn)利用含有BMSCs分泌的各種細(xì)胞因子的條件培養(yǎng)基，濃縮后添加到NSCs的培養(yǎng)基中，在完全去除BMSCs細(xì)胞本身，徹底避免了兩細(xì)胞間直接和間接相互作用的情況下，觀察到了NSCs的貼壁分化，這也進(jìn)一步肯定了MSCs旁分泌的細(xì)胞因子對(duì)于NSCs分化的促進(jìn)作用。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果肯定了富含BMSCs所分泌的細(xì)胞因子的條件培養(yǎng)基對(duì)NSCs貼壁分化的積極作用而不依賴于BMSCs細(xì)胞本身。同時(shí)也為BMSCs條件培養(yǎng)基與NSCs共同移植提供了依據(jù)，避免了BMSCs移植后的不確定性及潛在風(fēng)險(xiǎn)，為脊髓損傷細(xì)胞移植帶來(lái)了新的思路。

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［10］楊 早，楊 琴，賈延劫，等.相互間非接觸性共培養(yǎng)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞的影響［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30 （4）：823－6.

Effects of conditioned medium on neural stem cells in vitro

Song Peiwen，Xu Peng，You Tao，et al
（Dept of Orthopedics，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo observe the effect of the conditioned medium from bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs）on the differentiation of neural stem cells（NSCs）.MethodsThe morphology and immunocytochemistry profile of NSCs were investigated via culturing with the concentrated conditioned medium derived from the passage 3 BMSCs.ResultsIn the conditioned medium of BMSC treated group，the growth of NSCs was converted from floating to adherence gradually within 24h.Till the 3rd day，most floating cells were adhered to the plastic and extended long processes which formed a network with the migrating cells on the 7 th day.By immunocytochemistry examination，the cells differentiated from the adhering NSCs expressed the phenotypes of neurons and astrocytes.Nevertheless，the NSCs without BMSC-CM was keeping floating growth in control group and observed adhering to plastic rarely.ConclusionWithout the BMSCs themselves，the deliver factors secreted by BMSCs in the form of concentrated conditioned medium promote the differentiation of NSCs.

mesenchymal stem cell；neural stem cell；differentiation；conditioned medium

R 363

1000－1492（2014）05－0598－05

2014－02－24接收

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，合肥 230022

宋旆文，男，碩士研究生；

申才良，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：shencailiang1616＠163.com