超聲輔助酶法提取蝦黃油脂及其脂肪酸組成分析

劉文倩，王 燕，鄧放明，劉 焱，廖 泉

（湖南農業大學食品科學技術學院，食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

淡水小龍蝦，學名為克氏原鰲蝦（crayfish），是我國目前養殖面最廣、產量最大的淡水鰲蝦之一，其低脂、低膽固醇，富含肌球蛋白、礦物質和脂溶性維生素等[1]。小龍蝦雖營養價值高，但在加工過程中會產生大量副產物，這些副產物若處理不當不僅造成資源浪費，而且會導致嚴重的環境污染，如果進行有效處理則可以變廢為寶。國外學者研究發現，蝦的副產物相對于肉質來說蛋白質和灰分含量更高，同時脂肪酸組成以高含量的不飽和脂肪酸為主，如二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexenoic acid，DHA），這些脂肪酸可以降低患心血管疾病，中風和糖尿病的風險[2-3]。劉云等[4]還發現從副產物中提取的蝦油可顯著改善大鼠學習記憶能力，且效果優于深海魚油。因此開發淡水小龍蝦副產物，生產具有附加價值的產品成為近幾年的熱點和趨勢。目前，以蝦頭和蝦殼為原料制備的甲殼素、蝦青素、類胡蘿卜素、蛋白質和脂質等已廣泛應用于食品、醫藥和化工等行業[5-8]，而蝦黃的開發卻鮮有研究。本研究所選用的原料蝦黃位于蝦頭部，占全身質量的5%左右，含有豐富的不飽和脂肪酸、蛋白質、游離氨基酸和微量元素等[9-10]，是開發天然保健食品的良好來源。

動植物油脂提取的方法有有機溶劑法[11-12]、蛋白酶法[13]、超臨界二氧化碳法[2]等，并有以超聲波作為輔助手段[14-15]，本實驗采取超聲輔助蛋白酶法提取蝦黃油脂，旨在可以利用蛋白酶對蛋白質的水解，破壞蛋白與油脂的結合從而使油脂釋放出來，輔以超聲波以提高提取效率，并對提取后的蝦黃油脂進行脂肪酸組成分析，為蝦黃油脂的利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦黃 （鮮蝦水煮后、去殼、取蝦黃，用塑料袋真空密封后存放于－20 ℃冰箱中） 順祥水產食品有限公司；蛋白酶制劑（中性蛋白酶≥50 U/mg、酸性蛋白酶≥50 U/mg、堿性蛋白酶≥200 U/mg、木瓜蛋白酶≥200 U/mg、復合蛋白酶≥120 U/mg） 上海楷洋生物技術有限公司；三氯甲烷、無水乙醇、磷酸氫二鉀等為分析純。

1.2 儀器與設備

TD5A型離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；KQ-2500E型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；WFJ7200型可見分光光度計 尤尼柯儀器有限公司；RE52-3旋轉蒸發器 上海滬西分析儀器廠有限公司；KDN-103F自動定氮儀 上海仟檢儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋 北京市永生明醫療儀器廠。GC-2010PLUS氣相色譜儀（配FID檢測器） 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 蝦黃油脂的提取工藝

冰凍蝦黃解凍后，準確稱取10 g勻漿蝦黃至于150 mL錐形瓶中，加入一定量蒸餾水，在電動攪拌器上加熱并用磷酸緩沖液調至相應pH值，添加蛋白酶，在已設置好超聲溫度、時間和功率的超聲波清洗器中進行提取。酶解一段時間后轉移酶解液于離心管中，5 000 r/min離心15 min。離心結束后，將酶解液至于－20 ℃條件下冷凍過夜，40 ℃解凍離心以破乳[16]，將分離得到的油脂恒質量。

1.3.2 蝦黃油提取率的計算

1.3.3 超聲波輔助蛋白酶法提取蝦黃油脂條件優化

1.3.3.1 單因素試驗

按照1.3.1節方法提取蝦黃油脂，研究添加不同質量分數的蛋白酶（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、水料比（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1）、超聲酶解溫度（35、40、45、50、55 ℃）、超聲功率（0、50、75、100、125、150、175 W）、超聲時間（60、90、120、150、180 min）對蝦黃油脂提取率的影響。

1.3.3.2 響應面試驗

綜合單因素試驗結果，用SPSS軟件進行方差比較和多重分析，排除沒有顯著性影響的試驗因素，利用Design-Expert 7.0軟件按照Box-Behnken試驗設計原理設計響應面試驗。

1.3.3.3 蝦黃油的脂肪酸分析

以提取分離的蝦黃油脂為原料，進行脂肪酸成分分析，參照GB/T 9695.2—2008《肉與肉制品：脂肪酸測定》的方法進行脂肪酸的甲酯化。

氣相色譜條件：色譜柱：SP-2560（100 m×0.25 mm，0.2 μm）；進樣口溫度：230 ℃，檢測器溫度：250 ℃，程序升溫：初始溫度120 ℃保持3 min，以3 ℃/min升至230 ℃保持15 min；以5 ℃/min升至235 ℃保持3 min，分流比為50∶1，進樣體積1 μL，柱流量1.0 mL/min。面積歸一法確定脂肪酸的百分含量。

2 結果與分析

2.1 超聲輔助酶法提取蝦黃油脂單因素試驗結果

2.1.1 蛋白酶種類對蝦黃油脂提取率的影響

圖1 不同種類蛋白酶對蝦黃油脂提取率的影響Fig.1 Effect of protease type on the extraction yield of lipids from cray fish yolk

如圖1所示，蛋白酶水解克氏原螯蝦蝦黃后，油脂提取率由高到低依次為：復合蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶。同時，通過方差分析和多重比較結果顯示，添加蛋白酶的5組試驗提取率與空白組都有顯著性差異。這是由于不同蛋白酶作用于蛋白質的位點不同，催化活力不同造成的[17-18]。對于提取蝦黃油脂而言，復合蛋白酶的效果最好，故試驗選擇添加復合蛋白酶進行下一步研究。

2.1.2 復合蛋白酶添加量對蝦黃油脂提取率的影響

如圖2所示，隨著復合蛋白酶添加量的增加，蝦黃油脂的提取率呈現先增加后降低的趨勢，并在添加質量分數0.6%的復合蛋白酶時有最大值。這可能是由于當添加量低于質量分數0.6%時，隨著酶解反應的進行，蛋白酶破壞蛋白質和油脂結合的效果也隨之增強；而當添加量高于質量分數0.6%的時，底物由大分子球狀集團變成小分子鏈狀結構，降低了反應表面積，同時酶自身也存在一定的水解，使得蛋白酶活力降低[19-21]，因此繼續增加蛋白酶用量，提取率不會繼續增加，反而會有所降低，故添加質量分數0.6%的復合蛋白酶較為合適。

圖2 復合酶添加量對蝦黃油脂提取率的影響Fig.2 Effect of protamex concentration on the extraction yield of lipids from cray fish yolk

2.1.3 不同初始pH值對蝦黃油脂提取率的影響

圖3 初始pH值對蝦黃油脂提取率的影響Fig.3 Effect of initial pH value on the extraction yield of lipids from cray fish yolk

如圖3所示，通過方差分析和多重比較結果顯示，在pH值為6.0～8.0的范圍內，蝦黃油脂的提取率并沒有顯著性差異（P＞0.05），說明復合蛋白酶在pH值在6.0～8.0的范圍內均能作用于底物相應位點并發揮催化活性，使油脂分子釋放出來。同時經測定，原料的pH值為7.0～7.5，綜合考慮，選擇在原料自然初始pH值環境下進行酶解反應，既可以保證提取效果，也避免了加入緩沖液帶入的雜質。

2.1.4 水料比對蝦黃油脂提取率的影響

圖4 水料比對蝦黃油脂提取率的影響Fig.4 Effect of water-to-material ratio on the extraction yield of lipids from cray fish yolk

如圖4所示，在水料比1∶1～3∶1范圍內，蝦黃油脂提取率迅速上升，這是由于一定量的底物濃度有利于酶解反應和油脂分子的釋放，但在3∶1～5∶1范圍內，提取率沒有顯著性增長（P＞0.05），可能的原因是加水量過多，分子間距增大，底物濃度降低，影響酶解反應的進行，因此蝦黃油釋放量有所降低。故從實際生產成本考慮，在后續的試驗中，固定水料比為3∶1較為合適。

2.1.5 超聲酶解溫度對蝦黃油脂提取率的影響

圖5 超聲酶解溫度對蝦黃油脂提取率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on the extraction yield of lipids from cray fish yolk

由圖5可知，復合蛋白酶的最適溫度為50～55 ℃，且在50 ℃和55 ℃條件下處理，蝦黃油脂提取率差異不顯著（P＞0.05）。這與復合蛋白酶自身的最適酶解溫度有關，當溫度低于50 ℃時，隨著溫度的升高，蛋白酶分子活動逐漸活躍，加速了酶促反應的進行，從而促進了蛋白質和油脂的分離。繼續升高溫度會影響蛋白酶的活性，因而影響提取效果。故50 ℃為復合蛋白酶作用于蝦黃的最適溫度。

2.1.6 超聲功率對蝦黃油脂提取率的影響

圖6 超聲酶解功率對蝦黃油脂提取率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on the extraction yied of lipids from cray fish yolk

如圖6所示，通過方差分析和多重比較顯示，輔以超聲波提取的試驗組，其蝦黃油脂的提取率均高于對照組（58.6%），50 W和75 W處理差異不顯著，同時在125 W以后提取率基本趨于平衡不再增加。這是由于超聲波的強烈振動可以加速分子運動，破換細胞壁，使底物與蛋白酶的作用更加強烈從而進行有效提取。該試驗證實超聲波在蝦黃油脂的提取過程中具有實際效果和可行性。故選擇150 W為最適超聲波功率。

2.1.7 超聲酶解時間對蝦黃油提取率的影響

圖7 超聲酶解時間對蝦黃油脂提取率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic-assisted hydrolysis time on the extraction yield of lipids from cray fish yolk

圖7表明，在60～120 min內，隨著反應時間的延長，提取率增加較快，這是由于水解率會隨著時間的延長而增大，使得油脂的溶出率也逐漸增加。在120 min后，再延長時間，提取率沒有顯著性增大（P＞0.05），這可能是由于蛋白酶自身的水解造成分子質量濃度增大，不利于酶促反應的進行，因此120 min為最適酶解時間。

2.2 響應面分析法優化超聲輔助酶法提取蝦黃油脂的工藝

2.2.1 Box-Behnken試驗設計及結果

表1 超聲酶解條件響應面試驗及結果Table 1 Experimental design and results for response surface analysis

根據表1建立數學回歸模型，得到蝦黃油脂提取率（Y）的多元二次方程模型為：

表2 回歸方程的方差分析Table 2 Analysis of variance for the fitted regression model

由表2可知，模型P＜0.000 1，此回歸模型是顯著地，提取率P失擬=0.89＞0.05，表明失擬不顯著，模型系數的顯著性檢驗結果R2=0.931 8，變異系數為0.068 2，說明該模型能解釋93.18%的響應值的變化，擬合度較好，試驗誤差小。本實驗所建模型中各單因素的一次項、二次項、交互項中C、CD達到顯著水平（P＜0.05），AD、A2、C2、D2達到極顯著水平（P＜0.01），同時超聲酶解功率與蛋白酶添加量以及超聲酶解時間還存在交互作用并且交互作用也顯著。

2.2.2 因素間的交互作用對蝦黃油提取率的影響

圖8中等高線排列均勻且呈橢圓形，表示超聲功率和蛋白酶添加量、超聲酶解時間的交互作用顯著[22]。同時，在所選范圍內響應面存在最高點，即等高線圖中最小橢圓的中心點（圖中5點）。

圖8 因素間交互作用對蝦黃油脂提取率的影響Fig.8 Response surface and contour plots showing the effects of reaction conditions on the extraction yield of lipids from cray fish yolk

由圖8a可知，在蛋白酶添加量一定時，油脂提取率隨超聲功率增大持續升高，這是由于超聲波的強烈震動可以加速分子運動，具有穿透效應，因而功率越高，提取率越高。而在超聲功率一定的情況下，蝦黃油提取率隨蛋白酶添加量的增加出現先增大后降低的現象，并在添加質量分數0.6%的復合蛋白酶時有最大值。

由圖8b可知，超聲功率一定時，隨著超聲酶解時間的延長，蝦黃油提取率先增大后減小，并在120～125 min范圍內有最大值。同樣，超聲酶解時間不變，隨超聲功率的增大，提油率也出現先增后降的趨勢，最優范圍出現在150 W左右。這是由于酶解時間和功率間存在交互作用，功率較低時，需要充足的時間使油脂釋放，相反若功率增大，分子運動劇烈，則相對縮短時間可以達到較好效果。

2.2.3 最佳工藝參數的確定及模型驗證

利用Design-Expert 7.0軟件優化得到最佳工藝參數為水料比3∶1、添加質量分數0.6%的復合蛋白酶、超聲酶解時間124.94 min、超聲酶解溫度51.97 ℃、超聲功率152.23 W。在此條件下，蝦黃油脂的提取率為77.60%。考慮到實際操作的可行性，將提取工藝條件修正為添加質量分數為0.6%的復合蛋白酶、在超聲酶解時間125 min、超聲酶解溫度52 ℃、超聲功率150 W、通過3次平行驗證實驗，得到提取率平均值為77.86%，是優化前蝦黃油脂提取率的1.43 倍，因此該響應面模型可信度高，具有實用價值。

2.3 蝦黃油脂肪酸分析

表3 蝦黃油脂肪酸甲酯的組成及相對含量Table 3 Composition and relative contents of fatty acid methylesters from cray fish yolk oil

經GC分析，蝦黃油脂肪酸組成如表3所示，從提取的蝦黃油中共檢測出26 種脂肪酸，分布范圍從C14～C24，飽和脂肪酸共有10 種，相對含量為40.67%，不飽和脂肪酸共有16 種，相對含量為59.40%，其中多不飽和脂肪酸有9 種，占總量的27.92%，棕櫚油酸（14.88%）、油酸（16.42%）、亞油酸（15.76%）、α-亞麻酸（6.68%）、EPA（2.63%）含量較高。含α-亞麻酸、EPA和DHA 3 種ω-3脂肪酸，含亞油酸、γ-亞麻酸和花生四烯酸3 種ω-6脂肪酸，其脂肪酸組成與魚油類似，同時EPA含量與淡水魚類脂肪中的EPA含量相差不多[23-24]。

3 結 論

采用超聲輔助蛋白酶法提取蝦黃中的油脂，通過單因素試驗和響應面分析優化，得到提取的最佳工藝條件為水料比3∶1、添加質量分數0.6%的復合蛋白酶、在52 ℃條件下、用150 W的超聲波處理125 min，蝦黃油脂的提取率可以達到77.86%，是優化前的1.43 倍。超聲輔助酶法提取蝦黃油脂是一種經濟、安全、有效的方法。

對提取后的蝦黃油脂進行脂肪酸組成和含量分析，發現其不飽和脂肪酸，尤其是多不飽和脂肪酸種類多，含量高，具有較高的利用價值。可為長江中下游地區克氏原鰲蝦副產物的深加工，以及創造具有高附加價值的產品提供理論參考。

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