纈沙坦對人冠脈內皮細胞氧化應激過程中gp91Phox的影響

王 成，韓衛星，吳繼軍，劉 超，劉曉穎

纈沙坦對人冠脈內皮細胞氧化應激過程中gp91Phox的影響

王 成1，2，韓衛星1，吳繼軍1，劉 超3，劉曉穎4

目的研究纈沙坦對人冠脈內皮細胞（HCAEC）氧化應激過程中gp91Phox的影響。方法對照組：體外貼壁培養HCAEC，不進行其他干預；實驗組：相同培養條件下加入纈沙坦（10 μmol／L）培養24 h。應用Western blot法和細胞免疫熒光法測定兩組細胞中gp91Phox的水平，對兩組結果進行統計分析并比較。結果實驗組HCAEC中gp91Phox的水平明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。結論纈沙坦可以顯著減少HCAEC中尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶亞基gp91Phox的表達，從而降低氧化應激水平。

纈沙坦；人冠脈內皮細胞；氧化應激；gp91Phox

氧化應激是指機體內產生活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）系統的氧化作用水平與具有阻止其效應、修復其損害的抗氧化系統的抗氧化作用水平失衡。體內的ROS產生過多或機體的抗氧化能力減低，致使ROS清除不完全，而在機體內聚積，產生氧化性損傷［1－2］。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶是體內產生ROS的重要酶之一，是由細胞膜亞基gp91Phox、p22Phox，細胞漿亞基p40Phox、p47Phox、p67Phox以及小分子的GTP酶結合蛋白Rac組成的復合體［3］。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（angiotensin receptor blocker，ARB）成為目前臨床治療心血管系統疾病的常用藥，可干擾NADPH氧化酶以降低氧化應激水平。針對NADPH氧化酶所采用的抗氧化治療可能成為今后預防和治療與氧化應激有關疾病的作用靶點［4］，從而也為心血管疾病的臨床抗氧化治療提供一個新途徑。然而ARB類藥物如何通過NADPH氧化酶來降低氧化應激水平的具體途徑和機制尚不明確。該研究旨在探討ARB類藥物纈沙坦對人冠脈內皮細胞（human coronary artery endothelial cell，HCAEC）氧化應激過程中NADPH氧化酶亞基gp91Phox的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 HCAEC購自上海拜力生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；纈沙坦購自美國Sigma公司；小鼠抗人多克隆抗體gp91Phox購自美國Santa Cruz公司；小鼠抗人單克隆抗體β-actin、TRITC標記山羊抗小鼠IgG和辣根酶標記山羊抗小鼠IgG均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；BCA試劑盒和ECL發光試劑盒均購自美國Pierce公司；蛋白Marker購自北京全式金公司；DAPI購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞復蘇、培養和傳代 細胞復蘇、培養和傳代按常規方法操作。細胞以105密度傳代，傳代細胞隨機分兩組：一組作為對照組，對照組細胞常規培養，不做任何處理；另一組作為實驗組，實驗組在細胞傳代2 h后，細胞基本貼壁時，加入纈沙坦（10 μmol／L）并記時，待處理24 h后，取出兩組培養的細胞備用。

1.2.2 蛋白樣品的提取 分別取出上述兩組細胞置于冰上，吸出培養液，用預冷的PBS液洗3次，再加1 ml預冷PBS吹打貼壁細胞，收集實驗組和對照組的細胞于EP管中，4℃離心2 min（4 000 r／min），分別加入預冷細胞裂解液，在冰水中超聲裂解細胞15 s，4℃離心10 min（4 000 r／min），分別收集上清液于新EP管中，4℃離心20 min（14 000 r／min），此時上清液即為細胞質蛋白成分，沉淀部分用分析液溶解即為細胞膜蛋白成分。提取的細胞質和細胞膜蛋白，并用BCA試劑盒進行定量，加入上樣緩沖液，放入煮沸的水浴鍋內加熱5 min，－20℃保存備用。

1.2.3 Western blot法測定細胞中gp91Phox的水平

取出上述的蛋白樣品，行SDS-PAGE電泳分離蛋白質，5%濃縮膠以80 V電壓電泳約30 min，12%分離膠以100 V電壓電泳約120 min。完成后取出凝膠，以80 V電壓轉膜約60 min，將蛋白轉到PVDF膜上。取出PVDF膜，以5%脫脂奶溶液封閉2 h，再加小鼠抗人gp91PhoxIgG（1∶500）于4℃孵育過夜。以TBST洗膜3次，每次10 min，洗滌后加辣根酶標記山羊抗小鼠IgG（1∶5 000），室溫孵育2 h，同時以β-actin（1∶1 000）作為內參，最后用ECL發光試劑盒檢測，壓片曝光顯影。

1.2.4 細胞免疫熒光法測定細胞中gp91Phox的水平

細胞免疫熒光片的制作，常規傳代培養細胞，放入用多聚賴氨酸預處理的蓋玻片，2 h后待細胞基本貼壁時，實驗組加入纈沙坦（10 μmol／L），對照組不做任何處理，待24 h后取出蓋玻片，用PBS溶液洗3次，每次5 min，－20℃預冷的甲醛固定2 min，棄甲醛，70%乙醇室溫固定5 min，棄乙醇，PBS溶液洗3次，每次5 min。1%脫脂奶溶液封閉30 min，再加小鼠抗人gp91PhoxIgG（1∶100）室溫孵育2 h。以封閉液洗洗3次，每次5 min，再以TRITC標記山羊抗小鼠IgG（1∶200）作為二抗，室溫孵育1 h，PBS溶液洗3次，每次5 min，以0.5 μg／ml DAPI溶液100 μl覆蓋蓋玻片，室溫3 min，PBS溶液洗3次，每次5 min，用熒光封片膠封片，4℃避光儲存，隔夜后于熒光顯微鏡下拍照。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 Western blot法檢測纈沙坦對HCAEC中gp91Phox表達水平的影響與對照組比較，實驗組在HCAEC中gp91Phox表達水平明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1。

2.2 細胞免疫熒光法觀察纈沙坦對HCAEC中gp91Phox表達水平的影響采用細胞免疫熒光方法觀察結果如下：與對照組比較，實驗組在HCAEC中gp91Phox表達水平顯著降低，見圖2。

圖2 熒光顯微鏡觀察纈沙坦對HCAEC中gp91Phox蛋白表達的影響 ×1 000A、B、C：對照組；D、E、F：實驗組；1：DAPI染色示細胞核；2：TRITC標記gp91Phox蛋白；3：MERGE為相應組1和2兩個圖像的疊加

3 討論

冠心病已成為目前心血管疾病中導致猝死的主要原因之一，其發病原因已經不能完全用那些傳統危險因素加以解釋，如吸煙、糖尿病、高血壓和高血脂等。氧化應激作為一個新的角色，在冠心病的發生發展過程中起了重要的作用。氧化應激時機體內各種有害刺激導致ROS的產生，而抗氧化防御與其嚴重失衡，致使ROS積蓄，從而引起細胞毒性反應和組織損傷［5］。當ROS生成過多而抗氧化酶活性不足時，就會引起蛋白質、脂質以及核酸等的氧化性損傷，造成細胞生物學功能發生障礙，從而引起相關疾病發生、發展［6］。

氧化應激在動脈粥樣硬化發生、發展的眾多危險因素以及分子水平損傷機制里都有其參與［7］。研究［8］表明ROS不僅存在于動脈粥樣硬化的發病機制，而且病程進展中也一直有ROS的存在。冠狀動脈斑塊的形成以及破裂與ROS的氧化性損傷作用有關，其可以作用于血管內皮細胞和血管平滑肌細胞，從而引起多種細胞因子產生及活化，導致內皮細胞發生凋亡以及血管平滑肌細胞產生遷移，最終引起冠狀動脈內斑塊的形成以及破裂。Honjo et al［9］研究發現，在冠狀動脈粥樣硬化患者的冠脈中NADPH氧化酶的表達顯著增強，并且脈管中被氧化的低密度脂蛋白的分布也與NADPH氧化酶以及ROS有著密切的聯系，氧化型低密度脂蛋白是導致內皮細胞損傷以及誘導內皮細胞內促炎癥因子表達的重要原因，脈管中的NADPH氧化酶、ROS以及低密度脂蛋白形成了一個惡性循環。

動脈粥樣硬化是冠心病發病的基礎，而動脈粥樣硬化是一種由于氧化應激引起和放大的血管壁的炎性反應，而ARB類藥物可以降低氧化應激水平［10］。內皮功能障礙是動脈粥樣硬化發生的第一步，腎素－血管緊張素系統在發展內皮功能障礙和動脈粥樣硬化中扮演重要的角色，許多臨床試驗［11］顯示ARB類藥物能減少心血管疾病的發生，表明ARB類藥物能預防和延遲動脈粥樣硬化。臨床中運用ARB類與他汀類藥物聯合用藥治療心血管系統疾病，可以更好的降低組織的氧化應激水平，比兩者單獨使用更加有效［12］。氧化應激在眾多的心血管疾病尤其是在冠心病的發生發展中有著重要的作用，傳統治療方法療效始終有限，而介入支架治療創傷性較大且治標不治本，容易二次堵塞，因此在傳統治療方法上聯合抗氧化治療已成為一種趨勢，而ARB類藥物也成為目前臨床首選的抗氧化治療藥物之一。雖然目前臨床抗氧化治療冠心病尚未取得預期的療效，但隨著對氧化應激研究的不斷深入，新型抗氧化劑的發現，冠心病的治療定會取得滿意療效。

鑒于ARB類藥物對NADPH氧化酶的影響，本實驗研究了ARB類藥物對NADPH氧化酶亞基gp91Phox的影響，并表明纈沙坦可以抑制HCAEC的NADPH氧化酶亞基gp91Phox的表達，纈沙坦可以抑制血管的氧化應激反應，提示可能是ARB類藥物能夠降低氧化應激水平的機制之一；同時，也說明纈沙坦對冠狀動脈氧化應激狀態有抑制作用，應該對冠心病的防治有益。但ARB類藥物對NADPH氧化酶的其他亞基影響及作用機制，將是本實驗室接下來需要研究的。

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Effect on gp91Phoxhuman coronary artery endothelial cells in the process of oxidative stress by valsartan

Wang Cheng1，2，Han Weixing1，Wu Jijun1，et al
（1Dept of Cardiology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of Diagnostics，The First Clinical College of Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo study the effect on human coronary artery endothelial cells（HCAEC）gp91Phoxin the process of oxidative stress by valsartan.MethodsThe control group：adherent culture HCAEC in vitro，no other intervention；the experimental group：under the same conditions with valsartan（10 μmol／L）train for 24 hours.U-sing Western blot and cell immunofluorescence measure gp91Phoxlevels in two groups of cells.The results were statistically analyzed and compared in both groups.ResultsThe experimental group gp91Phoxlevel significantly lower than the control group in HCAEC（P＜0.01），the difference was statistically significant.ConclusionValsartan can significantly decrease the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate（NADPH）oxidase subunit gp91Phoxexpression in HCAEC，thus reduce oxidative stress level.

valsartan；HCAEC；oxidative stress；gp91Phox

R 541.4；R 972＋.4

A

1000－1492（2014）06－0739－04

2014－02－17接收

國家自然科學基金（編號：81070210）

1安徽醫科大學第一附屬醫院心血管內科，合肥 230022安徽醫科大學2第一臨床學院診斷學教研室、3基礎醫學院組織與胚胎學教研室、4生命科學院細胞生物學教研室，合肥 230032

王 成，男，碩士研究生；韓衛星，女，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：ayhwx57＠163.com