淫羊藿苷對人牙周膜細胞OCN表達水平的影響

趙弼洲 ，田佳靈 ，余占海 ，胡永壽 ，馬海冰

1甘肅省中醫(yī)院口腔科，甘肅 蘭州 730050；2蘭州大學口腔醫(yī)學院

淫羊藿苷(icariin，ICA)是植物淫羊藿莖葉中提取的總黃酮的主要有效成分。已有研究證實其可促進成骨細胞增殖，并可誘導骨髓基質干細胞向成骨細胞分化［1-2］。人牙周膜細胞是一個混雜細胞群，其中的骨向分化亞群及未分化間、充質細胞可在一定條件下增殖分化形成牙骨質或牙槽骨，這是牙周修復再生的重要基礎［3-4］。骨鈣素(osteocal in，OCN)是細胞礦化過程中表達的標志性蛋白，由成骨細胞產生，可反映成骨細胞的活躍程度［5］。本研究通過探討淫羊藿苷對原代培養(yǎng)人牙周膜細胞OCN表達水平的影響，為其在治療牙周病方面的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 淫羊藿苷(中國藥品生物制品檢定所，批號：110737-200415)；高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；胰蛋白酶(Sigma，美國)；SP-9002免疫組化染色試劑盒(ZYMED，美國)；波形絲蛋白抗體、角蛋白多克隆抗體、DAB顯色液(北京中杉金橋生物有限公司)；抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松(Sigma，美國)；茜素紅S(上海生工生物技術公司)；人骨鈣素El isa試劑盒(R&D，美國)。

1.2 儀器 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Heraeus，德國)；YJ-8175型超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；Powerwave X自動酶標分析儀(Bio-Tek，美國)。

1.3 人牙周膜細胞原代培養(yǎng)及鑒定 選擇12～14歲正畸患者減數拔除的健康前磨牙，在超凈工作臺內，用無血清含雙抗的DMEM沖洗4～5遍。手術刀片刮取根中1/3牙周膜組織，置于離心管內，滴加少量0.25%胰蛋白酶使離心管內組織完全浸沒，37℃消化10分鐘，加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液終止消化。800轉離心5分鐘，棄去上清，留少量培養(yǎng)液。將殘留的少量培養(yǎng)液與組織塊一同吸出，轉移至35mm培養(yǎng)皿，將組織塊在培養(yǎng)皿底分散擺放，蓋玻片緩慢覆蓋組織塊，使培養(yǎng)液充盈于組織與蓋玻片之間。添加培養(yǎng)液2mL，將培養(yǎng)皿置二氧化碳培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，隔天觀察。每3天半量換液，待細胞生長鋪滿80%培養(yǎng)皿，消化后按1∶3傳代。選取第2代細胞按SP法細胞免疫化學染色，鑒定細胞來源。

1.4 茜素紅染色 取第2代人牙周膜細胞消化后輕輕吹打為細胞懸液，計數以5×104/mL密度接種于2塊6孔板，每孔2mL，培養(yǎng)24小時待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液。一塊加入DMEM礦化誘導培養(yǎng)液 (含5%胎牛血清，10mmol/L β-甘油磷酸鈉，50μg/mL抗壞血酸，1×10-8mol/L地塞米松)2mL。另一塊6孔板加入含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，作為對照組。每3天半量換液1次，培養(yǎng)21天。行茜素紅染色，觀察礦化結節(jié)。

1.5 人牙周膜細胞骨鈣素(OCN)表達水平的測定 將第3代人牙周膜細胞消化后以5×104/mL接種于24孔板，待細胞鋪滿24孔板底80%后棄去培養(yǎng)液，按藥物濃度分為6組，每組6孔，分別加入含 10、1、0.1、0.01、0.001、0μg/mL淫羊藿苷的DMEM礦化誘導培養(yǎng)液每孔1mL，繼續(xù)培養(yǎng)。72小時后吸取培養(yǎng)液上清，低溫3 000轉20分鐘離心后分裝，按人骨鈣素El isa試劑盒說明進行操作，各濃度樣本設6個復孔，在酶聯免疫檢測儀450 nm處檢測各樣本孔吸光度值。以標準物的吸光度值和濃度繪制標準曲線，根據標準曲線依據各樣本吸光度值計算出樣本濃度。

1.6 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行數據統計，計量資料以(χ±s)表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人牙周膜細胞形態(tài)學變化情況 培養(yǎng)4天左右，組織塊周圍可觀察到細胞游出。細胞呈梭形，胞核清晰，折光性好(圖1)；到第10天，組織塊周圍多處有細胞游出，細胞數量明顯增多，在組織塊邊緣呈放射狀、螺旋狀走形(圖2)。

2.2 細胞鑒定 原代培養(yǎng)人牙周膜細胞免疫化學染色顯示：波形絲蛋白染色陽性，表現為胞質棕黃色著色；角蛋白染色陰性，未見著色，說明是中胚層來源細胞(圖3—4)。

圖1 培養(yǎng)4天的人牙周膜細胞形態(tài)學（組織塊周圍出現細胞）(×100)

圖2 培養(yǎng)10天的人牙周膜細胞形態(tài)學（細胞呈放射狀、旋渦狀走形）(×100)

圖3 原代培養(yǎng)人牙周膜細胞免疫化學染色圖（波形絲蛋白染色陽性）(×400)

圖4 原代培養(yǎng)人牙周膜細胞免疫化學 染色圖（角蛋白染色陰性）(×400)

2.3 茜素紅染色 隨培養(yǎng)時間的增長，細胞密度均逐漸增大，呈漩渦狀復層生長。行茜素紅染色后可見礦化誘導培養(yǎng)組形成多處紅染礦化結節(jié)，而對照組僅可見到極少數紅染礦化結節(jié)，說明原代培養(yǎng)的人牙周膜細胞可在礦化誘導條件下骨向分化，并形成細胞外礦化結節(jié)，見圖5—6。

圖5 礦化誘導培養(yǎng)液培養(yǎng)(×100)

圖6 DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)(×100)

2.4 淫羊藿苷對人牙周膜細胞骨鈣素(OCN)表達水平的影響 人牙周膜細胞在礦化誘導條件下與不同濃度淫羊藿苷作用72小時后，1～0.01μg/mL組的OCN表達水平均較對照組顯著增加(P＜0.05)，0.001μg/mL組的OCN表達水平較對照組高，但無統計學意義(P＞0.05)。10μg/mL組OCN表達水平較對照組低，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 淫羊藿苷對人牙周膜細胞OCN表達水平的影響(A450)

3 討論

牙周膜細胞在正畸牙移動過程中及牙周病或外傷所致牙周破壞的再生與修復中起重要作用［6-8］。Seo等［9］研究發(fā)現，牙周膜細胞中存在一種具有高增殖能力、自我更新能力和多向分化潛能的干細胞，這種細胞可在體內形成牙周膜/牙骨質樣組織。在不同培養(yǎng)條件下，這種細胞可分化為成牙骨質樣細胞、成骨細胞、脂肪細胞以及膠原蛋白形成細胞［10-11］。在一定條件下體外培養(yǎng)可形成礦化結節(jié)，并表達成骨相關蛋白，如堿性磷酸酶、骨涎蛋白、骨鈣素等［12-14］。本研究將原代培養(yǎng)的人牙周膜細胞在礦化誘導條件下培養(yǎng)21天后，行茜素紅染色，可見有紅染的礦化結節(jié)形成，說明其在一定條件下，可骨向分化。一般認為，形成骨樣礦化結節(jié)需要經歷3個階段：增殖期，細胞外基質成熟期以及礦化形成期［15］。

淫羊藿苷是中藥淫羊藿中提取的黃酮類天然藥物，具有抗腫瘤、增強免疫功能、改善心腦血管功能、調節(jié)內分泌等多重藥理作用［16］。體外研究已證實，淫羊藿苷可抑制破骨細胞分化及其功能，還可促進骨髓基質干細胞骨向分化［17-18］。OCN是成骨細胞的特征性表型之一，其由成骨細胞產生,主要功能包括促進骨的正常礦化，調節(jié)礦化成骨過程［5］。Shur l等［19］研究證實 OCN是牙體硬組織中一種重要的非膠原蛋白，牙周膜細胞也可合成分泌OCN，并能促進牙槽骨和牙骨質的礦化，是牙周組織修復再生的重要機制。本研究將人牙周膜細胞在礦化誘導條件下與不同濃度淫羊藿苷作用72小時后，El isa法檢查OCN表達水平發(fā)現，1～0.01μg/mL組的OCN表達水平均較對照組顯著增加(P＜0.05)，但不呈現濃度依賴性。10μg/mL組OCN表達水平較對照組低(P＜0.05)，可能是藥物毒性抑制了細胞的增殖與分化。

本研究結果表明，人牙周膜細胞具有骨向分化的能力，而一定濃度的淫羊藿苷可促進骨向分化，可為其在促進牙周組織修復再生方面的應用研究提供依據，但具體作用機制仍不明確，有待進一步研究證實。

［1］ Ma HP，Ming LG，Ge BF，et al.Icariin is more potent than genistein in promoting osteoblast di f ferenti ation and mineralization in vitro［J］.J Cel l Biochem，2010，112(3)：916-923.

［2］ 吳濤，徐俊昌，南開輝，等.淫羊藿苷促進羊骨髓間充質干細胞的增殖和成骨分化［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2009，13(19)：3725-3729.

［3］ Chadipiral la K，Yochim JM，Bahuleyan B，et al.Osteogenic dif ferentiation of stem cel ls derived f rom human periodontal l igaments and pulp of human exfol iated deciduous teeth［J］.Cel l Tissue Res，2010，340(2)：323-333.

［4］ Washio K，Iwata T，Mizutani M，et al.Assessment of cel l sheets derived f rom human periodontal l igament cel ls：a pre-clinical study［J］.Cel l Tissue Res，2010，341(3)：397-404.

［5］ Lin L，Chen L，Wang H，et al.Adenovirus-mediated t ransfer of siRNA against Runx2/Cbfa1 inhibits the formation of heterotopic ossif ication in animal model［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，349(2)：564-572.

［6］ Kawarizadeh A，Bourauel CW，et al.Ear ly responses of periodontal l igament cel ls to mechanical stimulus in vivo［J］.J Dent Res，2005，84(10)：902-906.

［7］ Wescot t DC，Pinkerton MN，Gaf fey BJ，et al.Osteogenic gene expression by human periodontal ligament cel ls under cycl ic tension［J］.J Dent Res，2007，86(12)：1212-1216.

［8］ Lekic PC，Rajshankar D，Chen H，et al.Transplantation of labeled periodontal ligament cel ls promotes regeneration of alveolar bone［J］.Anat Rec，2001，262(2)：193-202.

［9］ Seo BM，Miura M，Gronthos S，et al.Investigation of mul tipotent postnatal stem cel ls f rom human periodontal ligament［J］.Lancet，2004，364(9429)：149-155.［10］Flores MG，Yashiro R，Washio K，et al.Periodontal ligament cel l sheet promotes periodontal regeneration in athymic rats［J］.J Clin Periodontol，2008，35(12)：1066-1072.

［11］Iwata T，Yamato M，Tsuchioka H，et al.Periodontal regeneration with mul ti-layered periodontal l igamentderived cel l sheets in a canine model［J］.Biomaterials，2009，30(14)：2716-2723.

［12］ Lekic P，Rojas J，Birek C，et al.Phenotypic comparison of periodontal ligament cel ls in vivo and in vit ro［J］.J Periodontal Res，2001，36(2)：71-79.

［13］ Murakami Y，Kojima T，Nagasawa T，et al.Novel isolation of alkal ine phosphatase-positive subpopulation f rom periodontal l igament f ibroblasts［J］.J Periodontol，2003，74(6)：780-786.

［14］Wu L，Wei X，Ling J，et al.Ear ly osteogenic dif ferential protein profi le detected by proteomic analysis in human periodontal l igament cel ls［J］.J Periodontal Res，2009，44(5)：645-656.

［15］ Kul terer B，Friedl G，Jandrositz A，et al.Gene expression prof il ing of human mesenchymal stem cel ls derived f rom bone marrow during expansion and osteoblast di f ferentiation［J］.BMC Genomics，2007(8)：70.

［16］李娌，王學美.淫羊藿苷藥理作用研究進展［J］.中國中藥雜志，2008，33(23)：2727-2732.

［17］張大威，程巖，張金超，等.淫羊藿苷對破骨細胞的分化及骨吸收功能的影響［J］.中國藥理學通報，2007，23(4)：463-467.

［18］陳克明，葛寶豐，馬慧萍，等.淫羊藿苷對體外培養(yǎng)骨髓基質干細胞成骨性分化的影響［J］.中國骨質疏松雜志，2008，14(9)：642-645.

［19］ Shur l I，Solomon R，Benayahu D.Dynamic interaction of chromation related mesenchymal modulator,a chro modamain hel icase-DNA-binding protein with promoters in osteoprogenitors［J］.Stem Cel l，2006，24(5)：1288-1293.