多巴反應性肌張力障礙患者的GCH1基因突變檢測

陳延國 崔桂云 沈 霞 牟英峰△

多巴反應性肌張力障礙（dopa－responsive dystonia，DRD）是一種臨床上較為少見的遺傳性運動障礙疾病，發病率約1／200萬，最早由Segawa［1］報道，又稱Segawa病。Ichinofe等［2］首次將DRD致病基因精確定位于14q22.1－22.2，并發現4種突變。到現在為止，世界范圍內關于GCH1突變的報道100多種，已知突變位點90%以上位于GCH1基因1～6號外顯子上，少數位于內含子部分（http：／／www.hgmd.org）。GCH1基因表達的蛋白產物GTP環化水解酶1（GCH1），是BH4生物合成過程中的限速酶，而BH4作為重要的生物活性物質，參與苯丙氨酸代謝和單胺類神經遞質的合成［3－5］。已有相關研究發現，GCH1基因突變通過引起GCH1蛋白合成水平及活性下降，從而導致DRD的發病［6－7］。

目前關于DRD患者的診斷以臨床癥狀為主要依據，誤診率高。我們對徐州地區21例散發型多巴反應性肌張力障礙患者的GCH1基因進行檢測，以探索GCH1基因檢測作為DRD早期診斷工具的可行性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 21例DRD患者均來自徐州醫學院附屬醫院門診及住院病人，均符合DRD的診斷標準［1，8］。所有病人均知情同意，并定期隨訪。

1.2 主要試劑 血液基因組DNA提取試劑盒離心柱型，購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA分子量標記Marker 1，購自天根生化科技（北京）有限公司；2×Taq PCR Master Mix（不含染料）購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標本采集：取肘靜脈血5mL，EDTA抗凝，－20℃冰箱保存。

1.3.2 基因組DNA的提取：應用天根公司的全血基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取血樣中DNA。DNA產物保存在－20℃，以防DNA降解。

1.3.3 引物設計與合成：使用加拿大生物研究所提供的Primer3在線軟件（http：／／www－genome.wimit.edu／cgi－bin／primer3.cgi／）設計引物，由生物工程（上海）有限公司負責合成。設計引物見表1。

表1 GCH1基因PCR擴增引物序列

1.3.4 聚合酶鏈反應（PCR）及擴增產物檢測：25μL反應體系：基因組DNA 2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，2× Taq PCR Master Mix 12.5μL，雙蒸水8.5μL。反應條件：95℃預變性3min，95℃變性5min，60℃（exon1）退火45s，30個循環；72℃充分延伸10min 4℃保存。上述為exon1的反應條件。exon2、exon5及exon6的退火溫度59℃，exon3、exon4的退火溫度58℃。擴增產物經聚丙烯酸胺凝膠電泳。電泳后凝膠經固定液固定、染色液染色、一蒸水漂洗、顯色液顯色，最后拍照或用圖像處理系統進行掃描。

1.3.5 GCH1基因測序：全部測序工作由上海生物工程公司測序部完成，DNA測序圖由其提供。

2 結果

2.1 聚丙烯胺凝膠電泳檢測 電泳圖提示擴增產物片段長度100～500bp，符合目標片段長度，均為單一目的條帶，特異性好，提示擴增成功。見圖1。

2.2 GCH1基因測序 GCH1基因外顯子編碼序列未發現基因突變。僅在4份樣本的1號外顯子發現了1個堿基變異，通過查詢NCBI的SNP數據庫，該堿基變異為單核苷酸多態（SNP）。該SNP位于GCH1基因1號外顯子，第68位的堿基C／T多態，不存在氨基酸的改變。部分外顯子測序結果見圖2、圖3。

圖1 PCR產物聚丙烯酰胺凝膠電泳1：Marker；2、3：exon1；4、5：exon2；6：exon3；7：exon4；8、9：ex－on5；10、11：exon6

圖2 Exon1測序圖，箭頭所示為所發現的單核苷酸多態位點c.68C＞T

圖3 Exon2測序圖，未發現堿基改變

3 討論

本研究中，我們對徐州地區21例散發型多巴反應性肌張力障礙患者的GCH1基因進行檢測，未發現基因突變。但中國各地均有研究陸續報道了DRD患者GCH1基因突變［9－11］。在對本地區21例多巴反應性肌張力障礙患者研究中未發現GCH1基因突變，由于本組DRD患者沒有家族史，有報道稱DRD也可能存在其他致病基因［12］。

我們的測序結果僅在4份樣本的1號外顯子發現了1個堿基變異，通過查詢NCBI的SNP數據庫，該堿基變異為SNP。該SNP位于GCH1基因1號外顯子，第68位的堿基C／T多態，不存在氨基酸的改變。Jorge等［13］研究單核苷酸突變對剪切的影響，還推測其可能與遺傳多樣性相關。而通過關聯分析、生化、細胞水平等方面的研究，SNP可能通過基因轉錄水平、轉錄后水平、翻譯水平、翻譯后蛋白修飾劑蛋白細胞的定位等多種平臺對基因功能表達產生影響［14］。我們所檢測到的SNP位點是否與DRD的發病相關，需要進一步研究。

目前DRD的診斷主要通過臨床癥狀。雖然該病具有晨輕暮重、小劑量左旋多巴有效、兒童起病多見等臨床特點，但臨床表現多樣，頭顱MRI、CT、腦電圖檢查缺乏特異性，故仍有較高的漏診或誤診率。我們進行本研究的目的是檢驗基因突變檢測是否可以用于診斷DRD，我們的研究結果不支持GCH1基因突變檢測是診斷DRD的生物學標記。

綜上所述，DRD患者可能存在其他致病基因，GCH1基因突變檢測目前仍不能作為該病早期診斷的依據，仍然需要繼續深入DRD致病基因的研究，篩查新的致病基因，為DRD的早期診斷探索新的依據。

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