醛糖還原酶基因5′端（AC）n多態性與糖尿病腎病、糖尿病周圍神經病變的相關性

雷佩佩　劉長山　王秀軍　薛亞梅

【摘要】 目的：探討2型糖尿?。―M）醛糖還原酶（AR）基因5′端的（AC）n的多態性與糖尿病腎?。―N）、糖尿病周圍神經病變（DPN）易感性的關系。方法：選擇本院2型DM患者119例為DM組，根據其同時伴（+）或不伴（-）DN與DPN，將DM組分為四個亞組：DN-/DPN-組、DN-/DPN+組、DN+/DPN-組、DN+/DPN+組；同時選取健康體檢者62例為正常對照（CON）組。采用聚合酶鏈反應（PCR）及尿素/甲酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染顯色法分析各組AR基因的二核苷酸（AC）n串聯重復序列的多態標記，比較各組間等位基因頻率和基因型頻率。結果：各組中Z-2等位基因頻率比較差異有統計學意義（P<0.05），其中在DN+/DPN+組最高，在DN-/DPN-組最低；Z+2等位基因頻率在DN-/DPN-組顯著增高，在DN+/DPN+組顯著降低，兩組比較差異有統計學意義（P<0.01）；純合子Z-2/Z-2基因型頻率在DN+/DPN+組顯著高于其余各組，而純合子Z+2/Z+2基因型頻率在DN-/DPN-組顯著高于其余各組。結論：Z+2等位基因是2型糖尿病患者發生DN及DPN的保護性基因；Z-2等位基因是DN易感基因，而病程和Z-2等位基因可能共同促進了DPN的發生。

【關鍵詞】 2型糖尿??； 醛糖還原酶； 糖尿病腎??； 糖尿病性周圍神經病變

糖尿病腎病（DN）及糖尿病周圍神經病變（DPN）均為較常見的糖尿病微血管并發癥（DMAP），嚴重影響患者生活質量。目前大量證據表明遺傳因素與環境因素同樣在DMAP的發生、發展中起重要作用，醛糖還原酶（AR）基因則是目前最受重視的候選基因之一。本研究旨在探討山東地區2型DM患者AR基因5′端的（AC）n的多態性與DN、DPN易感性的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 按照1999年WHO診斷標準選擇本院2012年3月-2013年8月住院或門診2型糖尿病患者119例為2型糖尿?。―M）組。根據其同時伴（+）或不伴（-）DN與DPN，將DM組分為四個亞組：DN-/DPN-組、DN-/DPN+組、DN+/DPN-組、DN+/DPN+組。其中DN診斷標準為6個月內連續3次測定UAER≥20 μg/min，并排除其他疾病所致的尿白蛋白異常和腎功能不全；DPN診斷標準：（1）肢體感覺及運動神經障礙癥狀：如患肢麻木、針刺或灼熱樣疼痛、蟻行感或踏棉墊感等；（2）深淺感覺明顯減退，跟腱反射減退或消失；（3）肌電圖檢查提示運動神經傳導速度（MNCV）、感覺神經傳導速度（SNCV）減慢；（4）排除其他原因所致周圍神經病變。以上患者排除糖尿病急性并發癥及甲狀腺、垂體疾病等其他內分泌疾病。同時選取健康體檢者62例為正常對照（CON）組，全部研究對象均來自山東地區人群，彼此間無血緣關系。考慮到隨年齡增加致機體老化對周圍神經病變的影響，本次研究排除年齡>65歲的患者，入選的DM患者病程均>7年。DM各組空腹血糖（FBG）及糖化血紅蛋白（HbA1C）均高于CON組；DM各亞組中，DN-/DPN+組及DN+/DPN+組病程均顯著高于其余各亞組，其余指標在各組間差異不明顯，見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 取凍存抗凝全血0.5 mL，用solarbio全血基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取DNA，-20 ℃保存。

1.2.2 聚合酶鏈反應（PCR） 引物序列參考文獻[1]設計，由上海生工生物工程公司合成。上游引物：Pr1 5′-GAATCTTAACATGCTCTGAACC-3′，下游引物：Pr2 5′-GCCCAGCCCTATACCTAGT-3′。PCR反應體系共25 μL：10×Buffer2.5 μL，dNTP、TagDNA聚合酶各0.25 μL，Pr1、Pr2各1.0 μL，模板DNA2.0 μL，滅菌三蒸水18 μL。參數如下：94 ℃預變性5min多30 s，94 ℃變性1min多30 s，56.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共33個循環，末次循環后于72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取10 μL的PCR產物與2 μL加樣緩沖液混勻后，于120 g/L聚丙烯酰胺凝膠上電泳（100 mV，15 h），保持低溫。凝膠用硝酸銀染色法顯示結果。

1.2.3 DNA測序 選取部分基因型為純合子的PCR產物送上海生物工程公司進行測序。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗、方差分析或Q檢驗，并確認符合Hardy-weinberg平衡，計數資料比較采用 字2檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5′端（AC）n雙核苷酸多態性檢測結果 CON組及DM各組均檢測到7種等位基因，將最常見的（AC）24命名為Z，并將（AC）n的重復數n為21、22、23、25、26、27依次命名為Z-6、Z-4、Z-2、Z+2、Z+4、Z+6。PCR產物長度132～144 bp。

2.2 AR等位基因頻率的比較 各組中Z-2等位基因頻率比較差異有統計學意義（P<0.05），其中在DN+/DPN+組最高，DN+/DPN-組次之，在DN-/DPN-組最低；Z+2等位基因頻率在DN-/DPN-組顯著增高，在DN+/DPN+組顯著降低，兩組比較差異有統計學意義（P<0.01）。

2.3 各組含Z+2等位基因基因型頻率分布 Z+2/Z+2基因型頻率在DN-/DPN-組顯著增高；X/X基因型頻率在DN+/DPN+組顯著增高。各組分別含Z+2、Z-2等位基因的基因型頻率分布情況見表3。

2.4 各組含Z-2等位基因基因型頻率分布 Z-2/Z-2等位基因頻率在DN+/DPN+組顯著高于其余各組；Y/Y等位基因頻率在DN-/DPN-組最高，在DN+/DPN+組最低，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

臨床研究表明DMAP的發生不總與血糖水平有關，高糖血癥不是DMAP唯一因素。目前多數學者認為，糖代謝的多元醇通路與DMAP有密切關系。AR是多元醇通路的限速酶，廣泛存在于神經、視網膜、晶體、腎小球和血管壁等非胰島素依賴性組織。在生理的血漿葡萄糖濃度下，AR對葡萄糖的親和力低（Km=70 mmol/L），所以該通路代謝率極低。當某些因素導致AR激活，它對葡萄糖的親和力明顯上升（其Km值減小近10倍），對葡萄糖的轉化能力亦增強，使山梨醇在細胞內大量產生，導致細胞膜的結構和功能受損而干擾細胞的正常代謝[1-2]。

本研究結果顯示：CON組及DM各組AR5′端（AC）n均存在7種等位基因（Z-6～Z+6）；Z+2等位基因頻率在DN-/DPN-組顯著增高，在DN+/DPN+組顯著降低，兩組比較差異有統計學意義（P<0.01），且Z+2/Z+2基因型頻率在DN-/DPN-組顯著高于其余各組，提示Z+2等位基因是DN及DPN的保護性基因；Z-2等位基因頻率在各組中有顯著差異（P<0.05），其中在DN+/DPN+組最高，DN+/DPN-組次之，在DN-/DPN-組最低，同時Z-2/Z-2基因型頻率在DN+/DPN+組亦顯著高于其余各組，提示Z-2等位基因是DN的易感基因；因隨機選的DPN+患者病程顯著高于其他各組（P<0.05），推測病程和Z-2等位基因可能共同促進了DPN的發生。這與1997年Heesom等[3]的研究基本一致。Yang等[4]研究顯示，Z-2等位基因攜帶者AR基因轉錄活性最高，進一步證明Z-2等位基因與DMAP有密切關系。但Park等[5]對韓國2型DM患者的研究中發現AR基因5′端多態性與DMAP易感性無關，Moczulski等[6]對高加索2型DM患者的研究發現，大量蛋白尿、微量蛋白尿及正常蛋白尿患者的Z-2和Z+2等位基因頻率并無明顯差異。國內外各種研究結果不盡相同，可能與種族、樣本數及臨床情況等不同有關，還需要多種族大樣本的聯合研究。

參考文獻

[1] Neamat - Allah M，Feeney S A，Savage D A，et al.Analysis of the association between diabetic nephropathy and polymorphism in the aldose reductase gene in type 1 and type 2 diabetes mellitus [J].Diabet Med，2001，18（11）：906-914.

[2] Radkin P.Risk factors for the development of complications of dia-betic complications[J].J Diabet Complications，1996，8（6）：195-200.

[3] Heesom A E，Hibberd M L，Millward A，et al.Polymorphism in the 5-end of the aldose reductase gene is strongly associated with the development of diabetic nephropathy in typeⅠdiabetes[J].Diabetes，1997，46（15）：287.

[4] Yang B，Mill Ward A，Demaing A.Functional differences between the susceptibility Z-2/C-106 and protectiveZ+2/T-106 promoter region polymorphisms of the aldose reductase gene may account for the association with diabetic micro vascular complications[J].BiochimBiophys Acta，2003，1639（1）：1-7.

[5] Park H K，Ahn C W，Lee G T，et al.（AR）n Polymorphism of aldose reduetase gene and diabetic microvasular complications in type 2 diabetes mellitus[J].Diabetes Res Cli Pract，2002，55（2）：151-157.

[6] Moczulski D K，Burak W，Doria A，et al.The role if aldose reductase gene in the susceptibility to diabetic nephropathy type2 （non-insulin-dependent） diabetes mellitus [J].Diabetologia，1999，4（2）：94-97.

（收稿日期：2013-09-07） （本文編輯：蔡元元）

3 討論

臨床研究表明DMAP的發生不總與血糖水平有關，高糖血癥不是DMAP唯一因素。目前多數學者認為，糖代謝的多元醇通路與DMAP有密切關系。AR是多元醇通路的限速酶，廣泛存在于神經、視網膜、晶體、腎小球和血管壁等非胰島素依賴性組織。在生理的血漿葡萄糖濃度下，AR對葡萄糖的親和力低（Km=70 mmol/L），所以該通路代謝率極低。當某些因素導致AR激活，它對葡萄糖的親和力明顯上升（其Km值減小近10倍），對葡萄糖的轉化能力亦增強，使山梨醇在細胞內大量產生，導致細胞膜的結構和功能受損而干擾細胞的正常代謝[1-2]。

本研究結果顯示：CON組及DM各組AR5′端（AC）n均存在7種等位基因（Z-6～Z+6）；Z+2等位基因頻率在DN-/DPN-組顯著增高，在DN+/DPN+組顯著降低，兩組比較差異有統計學意義（P<0.01），且Z+2/Z+2基因型頻率在DN-/DPN-組顯著高于其余各組，提示Z+2等位基因是DN及DPN的保護性基因；Z-2等位基因頻率在各組中有顯著差異（P<0.05），其中在DN+/DPN+組最高，DN+/DPN-組次之，在DN-/DPN-組最低，同時Z-2/Z-2基因型頻率在DN+/DPN+組亦顯著高于其余各組，提示Z-2等位基因是DN的易感基因；因隨機選的DPN+患者病程顯著高于其他各組（P<0.05），推測病程和Z-2等位基因可能共同促進了DPN的發生。這與1997年Heesom等[3]的研究基本一致。Yang等[4]研究顯示，Z-2等位基因攜帶者AR基因轉錄活性最高，進一步證明Z-2等位基因與DMAP有密切關系。但Park等[5]對韓國2型DM患者的研究中發現AR基因5′端多態性與DMAP易感性無關，Moczulski等[6]對高加索2型DM患者的研究發現，大量蛋白尿、微量蛋白尿及正常蛋白尿患者的Z-2和Z+2等位基因頻率并無明顯差異。國內外各種研究結果不盡相同，可能與種族、樣本數及臨床情況等不同有關，還需要多種族大樣本的聯合研究。

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[6] Moczulski D K，Burak W，Doria A，et al.The role if aldose reductase gene in the susceptibility to diabetic nephropathy type2 （non-insulin-dependent） diabetes mellitus [J].Diabetologia，1999，4（2）：94-97.

（收稿日期：2013-09-07） （本文編輯：蔡元元）

3 討論

臨床研究表明DMAP的發生不總與血糖水平有關，高糖血癥不是DMAP唯一因素。目前多數學者認為，糖代謝的多元醇通路與DMAP有密切關系。AR是多元醇通路的限速酶，廣泛存在于神經、視網膜、晶體、腎小球和血管壁等非胰島素依賴性組織。在生理的血漿葡萄糖濃度下，AR對葡萄糖的親和力低（Km=70 mmol/L），所以該通路代謝率極低。當某些因素導致AR激活，它對葡萄糖的親和力明顯上升（其Km值減小近10倍），對葡萄糖的轉化能力亦增強，使山梨醇在細胞內大量產生，導致細胞膜的結構和功能受損而干擾細胞的正常代謝[1-2]。

本研究結果顯示：CON組及DM各組AR5′端（AC）n均存在7種等位基因（Z-6～Z+6）；Z+2等位基因頻率在DN-/DPN-組顯著增高，在DN+/DPN+組顯著降低，兩組比較差異有統計學意義（P<0.01），且Z+2/Z+2基因型頻率在DN-/DPN-組顯著高于其余各組，提示Z+2等位基因是DN及DPN的保護性基因；Z-2等位基因頻率在各組中有顯著差異（P<0.05），其中在DN+/DPN+組最高，DN+/DPN-組次之，在DN-/DPN-組最低，同時Z-2/Z-2基因型頻率在DN+/DPN+組亦顯著高于其余各組，提示Z-2等位基因是DN的易感基因；因隨機選的DPN+患者病程顯著高于其他各組（P<0.05），推測病程和Z-2等位基因可能共同促進了DPN的發生。這與1997年Heesom等[3]的研究基本一致。Yang等[4]研究顯示，Z-2等位基因攜帶者AR基因轉錄活性最高，進一步證明Z-2等位基因與DMAP有密切關系。但Park等[5]對韓國2型DM患者的研究中發現AR基因5′端多態性與DMAP易感性無關，Moczulski等[6]對高加索2型DM患者的研究發現，大量蛋白尿、微量蛋白尿及正常蛋白尿患者的Z-2和Z+2等位基因頻率并無明顯差異。國內外各種研究結果不盡相同，可能與種族、樣本數及臨床情況等不同有關，還需要多種族大樣本的聯合研究。

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[4] Yang B，Mill Ward A，Demaing A.Functional differences between the susceptibility Z-2/C-106 and protectiveZ+2/T-106 promoter region polymorphisms of the aldose reductase gene may account for the association with diabetic micro vascular complications[J].BiochimBiophys Acta，2003，1639（1）：1-7.

[5] Park H K，Ahn C W，Lee G T，et al.（AR）n Polymorphism of aldose reduetase gene and diabetic microvasular complications in type 2 diabetes mellitus[J].Diabetes Res Cli Pract，2002，55（2）：151-157.

[6] Moczulski D K，Burak W，Doria A，et al.The role if aldose reductase gene in the susceptibility to diabetic nephropathy type2 （non-insulin-dependent） diabetes mellitus [J].Diabetologia，1999，4（2）：94-97.

（收稿日期：2013-09-07） （本文編輯：蔡元元）