產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌耐藥性及脈沖場電泳分型研究

程 霞，戎建榮

(1．山西省疾病預防控制中心，山西太原 030012;2．山西大醫(yī)院，山西 太原 030032)

近年來革蘭陰性桿菌的耐藥性十分嚴重，肺炎克雷伯菌在某些醫(yī)院重癥監(jiān)護病房的感染率日益升高，且對多種常用抗菌藥物耐藥性呈明顯上升趨勢。特別是近年來產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase，ESBLs)株和產(chǎn) AmpC 酶株的出現(xiàn)，引起了醫(yī)藥衛(wèi)生界的高度關注。ESBLs是由質(zhì)粒介導的能水解β-內(nèi)酰胺抗生素，并可被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑(如克拉維酸等)所抑制的一類β-內(nèi)酰胺酶。ESBLs能水解頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松等三代頭孢及氨曲南等單酰胺類抗菌藥物，給臨床抗感染治療造成極大困難［1］。ESBLs可以通過接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導等形式使耐藥基因在細菌之間相互擴散和傳播，從一個細菌傳遞到另一個細菌，甚至在不同的菌種之間傳遞［2］。最常見的ESBLs由TEM-1、2和SHV-1突變而來，它們主要由大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌屬產(chǎn)生，大部分是頭孢噻肟酶，少部分是頭孢他定酶，其次CTX-M(Toho)、SFO-1、BES-1酶等［3］。

本研究以肺炎克雷伯菌作為耐藥表型和基因類別的研究對象，對13種抗菌藥物的耐藥性和ESBLs菌株的篩選，并用凝膠脈沖場電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)對 ESBLs菌株進行分型，了解其流行情況并指導臨床用藥。鑒定細菌的耐藥特性和產(chǎn)ESBLs的情況，探討耐藥性與基因型的關系，對進一步認識超廣譜β－內(nèi)酰胺酶的特征，配合臨床合理使用抗生素具有積極意義。

1 資料與方法

1．1 一般資料

2012～2013年，在山西省人民醫(yī)院、山西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院和山西大醫(yī)院的住院和門診患者中分離出的肺炎克雷伯菌36株。

1．2 菌株鑒定

采用全自動微生物鑒定系統(tǒng)Vitek(生物梅里埃，法國)GNI卡鑒定確認。藥物敏感試驗:采用紙片擴散法(紙片為Oxoid公司，英國)，對13種抗菌藥物氨芐西林、頭孢哌酮、頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢他啶、亞胺培南、阿莫西林/棒酸、頭孢三嗪、慶大霉素、環(huán)丙沙星、阿米卡星、哌拉西林、頭孢呋肟進行檢測，結(jié)果依照按美國臨床實驗室標準委員會(CLSI)推薦的標準進行判別［3］。

1．3 菌株鑒定

采用E-test，頭孢他啶/棒酸和頭孢他啶檢測ESBLs(法國生物梅里埃產(chǎn)品)，結(jié)果＜4為陽性、≥4為陰性。

1．4 PFGE

1．4．1 所需脈沖場凝膠電泳試劑見表1。

表1 脈沖場凝膠電泳試劑配制表

1．4．2 操作步驟 a)挑取單個菌落接種于LB培養(yǎng)至細菌的對數(shù)生長期;離心收集細菌細胞;配制2%的低熔點瓊脂糖。b)酶切:切取適量用于酶切的膠塊，加入緩沖液洗滌，過夜酶切。c)電泳:配制1%的瓊脂糖膠，將膠塊及Marker放入凝膠孔中，并用1%的低熔點瓊脂糖封孔;電泳槽內(nèi)加入2 500 mL的0．5×TBE，冷卻溫度為8℃;選定脈沖參數(shù)，電泳。d)電泳結(jié)束后，凝膠用EB染色20～30 min，脫色15 min，將電泳結(jié)果直接在電腦中成像。

2 結(jié)果

2．1 ESBLs菌株

從36株肺炎克雷伯菌中，共發(fā)現(xiàn)ESBLs陽性菌株14株，分離率為39%。14株ESBLs肺炎克雷伯菌多重耐藥比較嚴重，36株肺炎克雷伯菌對13種抗生素的耐藥性最高為氨芐西林(90%)、哌拉西林(78%)、環(huán)丙沙星(77%)、阿莫西林/棒酸(64%)、慶大霉素(54%)、頭孢唑啉(46%)、頭孢哌酮(43%)、頭孢呋肟(34%)、頭孢噻肟(28%)、頭孢三嗪(27%)、頭孢他啶(19%)、阿米卡星(11%)和亞胺培南(0%)。從36株肺炎克雷伯菌中，共發(fā)現(xiàn)ESBL陽性菌株14株，分離率為39%。14株ESBL肺炎克雷伯菌多重耐藥比較嚴重，同時全部對環(huán)丙沙星耐藥，僅有3株對慶大霉素敏感，對阿米卡星敏感率為79%，全部對亞胺培南敏感。

2．2 PFGE 分型

通過限制性內(nèi)切酶Xab I對14株肺炎克雷伯菌ESBL(序號21－35)進行了DNA分型(見圖1)，菌株25與菌株27的基因片段數(shù)量和基因片段大小基本一致，具有同源性，是相關PFGE基因型，它們顯示來源一個相同菌株，其余肺炎克雷伯菌的基因片段數(shù)量和基因片段大小各不相同，顯示為不相關的PFGE型，此結(jié)果表明這些菌株來自于不同菌株。

2．3 14株ESBLs肺炎克雷伯菌患者特征

平均年齡68．5歲;男∶女 為3∶8;住院∶門診為8∶2。11例住院患者，住院天數(shù)＞20 d，2例門診慢性泌尿系統(tǒng)感染。由此可見，隨著年齡增長，免疫力低下，其他系統(tǒng)發(fā)生的感染，抗生素不正確長期使用，有可能增加ESBLs菌株發(fā)生。

圖1 產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌XbaⅠ酶切以后的脈沖場凝膠電泳(PFGE)圖譜

3 討論

近年來，肺炎克雷伯菌是醫(yī)院獲得性肺炎的重要致病菌，在社區(qū)獲得性和醫(yī)院獲得性革蘭陰性桿菌肺炎中分別占18% ～64%和30%［1］。患有多種慢性疾病如慢阻肺、糖尿病、肝硬化等老年患者，如果多次應用廣譜抗生素或者反復住院，容易合并克雷伯菌性肺炎。產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌多由質(zhì)粒編碼，通過轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)化和結(jié)合的方式在細菌間廣泛傳播ESBLs已成為細菌耐藥的突出問題。

由于產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌能水解絕大多數(shù)的頭孢菌素、青霉素和單酰胺類抗生素，而且對氨基糖苷類、氟喹諾酮類和磺胺類交叉耐藥，可對頭孢菌素和氨曲南耐藥，同時對其他藥物的耐藥性也有所增加，如氨基糖甙類和復方新諾明等。本研究分離菌株對氨芐西林、哌拉西林、環(huán)丙沙星、阿莫西林/棒酸、慶大霉素、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢噻肟、阿米卡星和亞胺培南等13種抗生素的耐藥性與國內(nèi)相關文獻報道相近［1］;實驗菌株中有14株產(chǎn)生ESBLs。因此，對于由肺炎克雷伯菌引起的慢性感染，臨床微生物室需要進行ESBLs檢測，確定其產(chǎn)生耐藥酶的情況。只有進行準確監(jiān)測，才能合理使用抗生素［2］。

隨著產(chǎn)ESBLs菌株的逐年增多，由此引發(fā)的細菌流行和交叉感染逐年增加，臨床應根據(jù)藥物敏感試驗結(jié)果和病原菌耐藥情況合理應用抗生素，同時積極治療基礎疾病和加強全身支持治療，預防交叉感染。

［1］ 王 琴，楊 萍，胡靜儀，等．60例肺炎克雷伯菌多重耐藥性及主要耐藥基因的研究［J］．天津醫(yī)藥雜志，2005，33(2):339．

［2］ Sandra Hoffmann，Michael B Batz，J Glenn Morris．Annual Cost of Illness and Quality-adjusted Life Year Losses in the United States due to 14 Foodborne Pathogens［J］．Journal of Food Protection，2012，75(7):1292-1302．

［3］ Nation Committee for Clinical Laboratory Standards．Clinical:Aboratory Standards of Antimicrobial Testings;Ninth Informational Supplement［S］．NCCLS，1999．