茶多糖對LPS活化單核巨噬細胞內活性氧的影響

王長文，馬洪波，張 鐸，趙文秀

（1.吉林醫藥學院公共衛生學院，吉林 吉林 132013；2.吉林醫藥學院檢驗學院，吉林 吉林 132013；3.吉林醫藥學院藥學院，吉林 吉林 132013）

我國產茶區分布廣，茶葉品種豐富，但對茶的成分和功效影響最大的是茶葉發酵程度。與非發酵茶比較，屬于發酵茶的紅茶糖類含量相對高，組成與結構穩定[1]。茶多糖是由多種單糖和糖基組成，體外研究表明，茶多糖對物理和化學來源的活性氧(reactive oxygen species，ROS）具有清除作用。細菌等微生物感染后，單核巨噬細胞、嗜中性粒細胞在細菌內毒素等刺激下，可產生大量ROS[2]。炎癥反應中免疫細胞內過量的ROS可破壞胞內的脂質、蛋白及細胞器；而釋放的ROS可導致肺泡和血管內皮等組織細胞的損傷[3]。茶多糖是否可調節LPS活化單核巨噬細胞內ROS水平還未見報道，本研究將以單核細胞系的U937細胞為模型，分析茶多糖對ROS的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗細胞 U937引自美國標準生物品收藏中心（American type culture collection，ATCC），液氮中凍存。

1.2 試驗藥品 細菌脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS），購自國家標準物質中心。異硫氰酸熒光素(fluo?rescein isothiocyanate，FITC），購自Sigma公司(美國）。活性氧探針雙氯熒光黃乙酸乙酯（Dichlorofluo?rescin diacetate，DCFH-DA），購自碧云天生物技術公司。Annexin-V和PI雙染凋亡檢測試劑盒，購自eBioscinedce公司(美國）。

1.3 試驗儀器 流式細胞儀為EPICS-XL型（美國貝克曼公司）。

1.4 茶多糖的提取、純化和標記 以福建“正山小種”紅茶為原料，水浸泡的方式提取茶多糖，大孔樹脂層析法制備純化的紅茶多糖(black tea polysac?charides，bTPS）。并采用酪胺還原法標記異硫氰酸熒 光 素(fluorescinisothiocyate，FITC），制 備 FITC-bTPS。將bTPS和FITC-bTPS（按bTPS計算）溶于PBS，配制為2mg/mL的儲存液，分裝后-20℃保存。1.5 細胞培養和干預 復蘇U937細胞，以含10%小牛血清的1640培養液在37℃、5%CO2和飽和濕度下培養。將細胞用培養液調為3×105/mL，按3mL孔接種于6孔板，加入不同濃度FITC-bTPS（0、10、20μg/mL和40μg/mL），繼續培養2 h后，收集細胞后通過檢測FITC的熒光分析bTPS與細胞的結合；用LPS（20 μg/mL）和FITC-bTPS（0、10、20 μg/mL和40μg/mL）同時處理細胞2 h，收集細胞后分析bTPS與細胞的結合。接種細胞，加入不同濃度的LPS（0、10、20μg/mL和40μg/mL），繼續培養4 h后，檢測細胞內ROS。用LPS（0 μg/mL和20μg/mL）處理和bTPS（0μg/mL和20μg/mL）處理細胞4 h，分析細胞內ROS和水平；并分析細胞凋亡。

1.6 細胞內活性氧檢測 收集細胞，用PBS調為密度2×106mL的細胞懸液，取500μL細胞懸液，加入DCFH-DA儲存液，至其終濃度為5μmol/L，混勻后在37℃避光反應30min，PBS洗2次后用流式細胞儀分析。

1.7 細胞凋亡分析 將細胞用PBS洗滌2次，用結合緩沖液調為2×106/mL的細胞懸液。取190μL細胞懸液，加入10μL FITC-標記Annexin-V，室溫下避光反應15min；離心棄上清，加入結合緩沖液500 μL，再次洗滌后，475μL結合緩沖液重懸細胞，接入PI溶液25μL，混勻后立即用流式細胞儀分析。

2 結果與分析

2.1 茶多糖與LPS競爭結合U937細胞 流式細胞術分析表明，FITC-bTPS可與U937細胞結合，熒光強度的均值代表細胞膜表面結合FITC-bTPS的相對量。與空白對照組比較（圖1A），相同處理時間，熒光強度均值伴茶多糖濃度增加而增加（圖1B～E）。來自植物、動物和微生物的多糖可與細胞膜的Toll樣受體家族結合，主要是TLT2、TLR4和TLR7等，即它們在細胞膜表面有共同的受體。為研究茶多糖是否與LPS競爭結合U937表面的受體，將20μg/mL的LPS和不同濃度的FITC-bTPS（0、10、20μg/mL和40μg/mL）同時處理細胞，分析熒光強度。LPS同時處理條件下，FITC熒光強度仍以濃度依賴的方式增加，但顯著低于FITC-bTPS單獨作用組（圖F～I）。該結果表明，茶多糖和LPS可競爭與U937細胞結合，提示兩者有共同的受體。

圖1 茶多糖與LPS競爭結合U937細胞

2.2 茶多糖和LPS對U937細胞ROS的影響 單核細胞、嗜中性粒細胞表面與LPS結合的主要是TLR4，LPS與TLR4結合可誘導細胞活化、細胞內活性氧增加。DCFH-DA進入細胞后被酯酶水解為DCFH，該物質被氧化后生成DCF，而DCF發射的熒光可采用流式細胞儀525 nm通道(FL1）來檢測,其熒光強度值代表細胞內ROS水平。我們發現，U937細胞內的ROS隨LPS濃度增加而增加（圖2A～D）。不同濃度未標記的茶多糖（bTPS）與20μg/mL的LPS處理細胞后，LPS所激發的ROS水平逐漸隨bTPS濃度增加而減少（圖2E～H）。該研究結果提示，茶多糖可能通過與LPS競爭結合U937細胞而降低細胞內過量ROS的產生。

圖2 茶多糖和LPS對U937細胞ROS的影響

2.3 茶多糖和LPS對U937細胞凋亡的影響 過量的ROS可使細胞發生凋亡、壞死和自噬等改變，導致組織損傷。為分析茶多糖對LPS誘導的細胞凋亡是否有影響，采用Annexin-V和PI雙染法檢測茶多糖和LPS處理后U937細胞亡的情況。與對照組比較（圖3A），20μg/mL的LPS可導致細胞發生早期凋亡、晚期凋亡和壞死（圖3B）；20μg/mL茶多糖處理后，細胞無顯著凋亡和壞死（圖3C）；與LPS單獨處理組比較，兩者共同作用組晚期凋亡和壞死細胞顯著減少（圖3D）。

圖3 茶多糖和LPS對U937細胞凋亡的影響

3 討論

研究表明，茶多糖具有多種生物活性，日常飲茶或攝入茶多糖有助于延緩衰老、預防心血管疾病和預防輻射損傷[4-5]。茶多糖成為茶葉中極具開發利用價值的生物活性物質，有必要深入了解其作用機制，以推動其應用。本研究證實發酵茶多糖可與單核細胞結合，并揭示了茶多糖可與LPS競爭結合細胞膜表面受體。在細菌內毒素刺激下，免疫細胞活化后產生ROS而殺傷細菌,是機體抗感染免疫的一種效應。但大量研究表明，過量的ROS導致感染后免疫細胞自身凋亡、壞死，并通過釋放游離的氧自由基，還導致組織損傷、細胞纖維化[6]。長期慢性的感染，炎癥反應所釋放的自由基還參與基因突變、誘發細胞癌變的過程。茶多糖具有抗氧化活性，但對其機制的深入研究較少，多限與其消除物理、化學法誘發ROS的炎癥。本研究結果提示，茶多糖可與LPS競爭結合單核細胞，從而降低細胞內ROS的水平，并減少LPS所導致的細胞凋亡和壞死。茶多糖消除ROS的機制涉及多方面，包括其還原性多糖直接消除ROS等，全面了解茶多糖消除ROS的機制還需要深入研究。

[1] 謝明勇，聶少平.茶葉多糖的研究進展[J].食品與生物技術學報，2006，25(2）:107-114.

[2] 黃利，夏鴻，倫玉寧，等.細菌內毒素體外刺激小鼠腹腔巨噬細胞分泌一氧化氮實驗模型的條件[J].南方醫科大學學報，2012，32(11）:1646-1650.

[3] 劉靜，張向陽.血管內皮細胞損傷與修復的機制的研究進展[J].新疆醫科大學學報，2009，32(9）:1385-1387.

[4] 沈健，陳增良，沈香娣，等.茶多糖抗腫瘤及其增強免疫作用的研究[J].浙江預防醫學，2007，19(8）:10-12.

[5]毛華，楚慧麗，劉月冉，等.免疫細胞多糖受體及其研究方法[J].食品與藥品，2011，13(3）:136-138.

[6] 樊軍，劉毅.細胞凋亡與低氧性肺損傷的研究進展[J].臨床軍醫雜志，2007，35(4）:617-620.