利用插入/缺失標記分析我國瓠瓜資源遺傳多樣性

魯忠富，王 莎，吳曉花，胡耀文，汪寶根，吳新義，徐 沛，李國景

（浙江省農業科學院蔬菜研究所,浙江杭州 310021）

利用插入/缺失標記分析我國瓠瓜資源遺傳多樣性

魯忠富，王 莎，吳曉花，胡耀文，汪寶根，吳新義，徐 沛，李國景

（浙江省農業科學院蔬菜研究所,浙江杭州 310021）

瓠瓜作為重要的葫蘆科作物之一,在我國已有悠久的栽培歷史。瓠瓜分子標記研究大大落后于黃瓜、白菜等作物,應用分子標記技術開展瓠瓜種質資源的遺傳多樣性和親緣關系研究,對促進瓠瓜重要種質資源的開發和利用具有重要意義。本研究選擇96份具有廣泛代表性的我國瓠瓜種質材料,利用插入/缺失分子標記技術,研究分析了其遺傳多樣性和親緣關系,探討我國瓠瓜品種間的基因差異和瓠瓜亞種間及亞種內的親緣關系。結果表明,瓠瓜種質遺傳相似系數0.30～1.00,在遺傳相似系數0.68處可將96份瓠瓜種質材料分為8類,各種質材料分布較平均；相同瓜型的材料有聚集在一起的趨勢,根據瓜型可將這96份瓠瓜種質大致分為3類。

瓠瓜；聚類分析；插入/缺失標記；遺傳多樣性

瓠瓜（Lagenaria siceraia（Molina）Standl.）為雌雄同株異花一年生草本植物（2n=2χ=22）,隸屬葫蘆科（Cucurbitaceae）葫蘆屬（Lage naria）,是世界上重要的葫蘆科作物之一［1］。瓠瓜原產赤道非洲南部低地［2］,是人類最早種植的作物之一,1萬年前就有考古學上的證據表明人類已開始種植瓠瓜。我國瓠瓜遺傳資源豐富,其栽培史可上溯到新石器時代,被認為是瓠瓜的次生起源中心之一［3］。瓠瓜在我國主要分布在長江流域及以南地區,近年來,山東、河北、河南等地也有栽培［4］,可作為瓜果蔬菜食用,既可燒湯做菜,又可腌制曬干；其成熟果還可用作容器或樂器；此外,瓠瓜可用作嫁接西瓜的砧木,用來預防西瓜枯萎病［3,5］。

目前瓠瓜分類主要根據種質資源的表型特征,按形態分,有圓柱形、牛腿形、手榴彈形等；按大小分,老瓜大的可達8～10 kg,小的不足0.1 kg；按嫩瓜顏色分,有深綠、淺綠、白色、白底帶花青斑等；按品質分有柔滑型、硬肉型（硬于黃瓜）；按口味分,有淡味型、甜味型、清苦型（類似苦瓜之苦味）、劇苦型；按生育期可分為早熟型、中熟型、晚熟型。此外,不同類型、不同品種的長勢強弱、抗病性、抗逆性等也都有差異［6-7］。但目前在DNA水平上檢測瓠瓜不同種質間遺傳多樣性的研究還較少。

我國瓠瓜生產上以瓠子類品種為主,種質來源局限性大,缺乏遺傳多樣性。近年來瓠瓜生產中病毒病、白粉病、枯萎病等病害多發,苦味瓜不時產生,商品瓜性狀多樣性跟不上消費者需求等問題日益嚴重,亟需拓寬栽培瓠瓜的遺傳多樣性,以培養新一代良種,為此有必要深入了解我國現有瓠瓜品種的遺傳多樣性和親緣關系。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料為浙江省農業科學院蔬菜所瓠瓜豇豆組歷年搜集并具有廣泛代性的96份地方品種資源所組成的自然群體。代號南秀為L S1,孝感瓠子為L S2,貴州圓瓠瓜為L S3,長瓠為L S4,龍巖長四月瓠為L S5,長蒲1為L S6,甬砧1號為L S7,新疆瓠瓜為L S8,東陽農家種1為L S9,白葫蘆為L S10,蕭山園蒲為L S11,廣東早瓠瓜為L S12,松桃瓠瓜為L S13,金錢蒲為L S14,全化蒲瓜為L S15,東陽農家種2為L S16,四川長瓠

瓜為L S17,臨夏瓠子為L S18,長蒲2為L S19,肖長蒲為L S20,湖南圓瓠瓜為L S21,小籽瓠瓜為L S22,長蒲3為L S23,安吉地蒲為L S24,武都瓠子為L S25,清秀為L S26,湖南瓠瓜為L S27,臺江瓠瓜為L S28,津勝特選為L S29,青砧為L S30,遼寧瓠子為L S31,蒲縣瓠瓜為L S32,新蔡瓠瓜為L S33,湖南圓瓠1號為L S34,G 22②①為L S35,紹興長瓜為L S36,短筒瓠子為L S37, G 32②②為L S38,杭州長瓜為L S40,云南農家種為L S41,麥瓠為L S42,小葫蘆為L S43,新選為L S44,漢龍青玉為L S45,長蒲4為L S46,極早熟瓠瓜為L S47,寧波夜開花為L S48,觀賞瓠子分離出為L S50,本地義序芋瓠瓜為L S53,南平青花插桿瓠為L S54,清流長芋瓠為L S55,思南瓠瓜為L S56,松桃瓠瓜分離為L S57,貴州長瓠瓜1為L S58,長瓠子為L S59,湖北瓠子為L S60,花皮葫蘆分離出為L S61,永泰圓筒瓠為L S63,貴州長瓠瓜2為L S64,榕江瓠瓜為L S65,正陽瓠瓜為L S66,湖南早瓠瓜為L S67,雄溪瓠瓜為L S68,菜葫蘆為L S69,三江口葫子為L S70,瓢葫蘆為L S71,九山園蒲1為L S72,麗水農家種為L S73,義烏農家種為L S75,東陽農家種分1為L S76,東陽農家種分2為L S77,東陽農家種分3為L S78,漢龍碧玉為L S79,葫蘆蒲為L S80,火焰蒲為L S81,金華農家種為L S82,九山園蒲2為L S83,南秀公主為L S84,爬地蒲為L S86,青皮圓蒲為L S87,三山牛腿蒲為L S88,紹興長蒲為L S90,透年蒲為L S91,腰葫蘆為L S93,引10-1②②為L S94,圓葫蘆為L S95,浙江圓瓠1號為L S96,園蒲為L S97,越蒲1號為L S98,云南為L S99,早熟瓠子為L S101,砧木為L S102,08扁蒲-1為L S103,G 26②①/②為L S104,J 077-1 I 77①為L S105和長條瓠瓜為L S106。

供試材料經浸種、催芽、育苗、移植等一系列處理后,使用改進的C T A B法提取基因組DNA［6-8］。

1.2 方法

1.2.1 插入/缺失標記的來源

本試驗所使用的插入/缺失標記是由瓠瓜豇豆組前期開展的RAD-Seq基因組測序開發而來,包括85條差異片段超過10 bp的多態性插入/缺失標記。

1.2.2 P C R反應條件

P C R體系包括10 ng的DNA,2.5 pm o l的引物,2.5 nmol的dN T P s,18.6 nmol的Mg C l2,0.2 U的r T aq酶以及10 xB uf f e r,用水補足體積至12.5 μL。P C R擴增程序為：①預變性94℃3 min；擴增循環：②變性94℃30 s,③退火52℃30 s,④延伸72℃40 s,②-④共重復36個循環；⑤72℃延伸5 min,⑥4℃保存。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

P C R產物在室溫條件下使用8%的垂直非變性聚丙烯酰胺凝膠（A c r∶B i s為19∶1或29∶1或39∶1）電泳分離,銀染法染色,拍照分析。根據電泳結果記錄清晰可重復的條帶,將電泳圖中同一位置上清晰且可重復的不同帶型分別賦值為0,1, 2,以此類推,統計各引物的多態性條帶的比率并作進一步分析。

1.2.4 遺傳多樣性分析

對每種基因型在每個位點上的等位基因數和出現頻率進行統計。使用P I C_C a l c0.6（ht t p：// w w w.e s ni ps.com/do c/9171097b-a c 41-424a-9d35-e 7d 4e 540e c 9f/P i c a l c）計算每個插入/缺失位點的P I C值,計算公式為：其中：Pij代表在第i個位點出現第j個等位基因的頻率［9］。使用N T SYSpc 2.10進行N e i's遺傳距離計算（D A）和主坐標分析（P C o A）。最后根據D A的結果用SA H N程序中的U P G MA法進行聚類分析,并用E I G E N程序求特征值和特征向量進行主坐標分析,用T r e eP l o t模塊生成聚類圖,構建分子進化樹,用3DP l o t生成主坐標圖。

2 結果與分析

等位基因變異的多態性位點數和百分率不僅可以反映植物的多態性指數,而且可以評價引物反應多樣性信息量的多少。本研究從85條插入/缺失引物中共篩選出22條多態性較好且能穩定擴增的引物。不同的引物所產生的條帶數不同,最多的為8條（如引物插入/缺失-33590）,最少的為1條（如引物插入/缺失-24033）,擴增的DNA片段大小范圍為75～500 bp,除了插入/缺失-17370（多態性條帶大小為500 bp左右）,多態性條帶大小均為100～200 bp。22條引物共擴增出64條帶,其中27條帶表現出多態性,平均每條引物擴增2.78條帶,平均多態性比例為42.19%（表1）。

基于插入/缺失擴增的22個多態性標記,通過N T SY S-pc（2.1版）軟件對96份瓠瓜種質資源進行了聚類分析,得到了基于插入/缺失的聚類樹狀

圖（圖1）。瓠瓜種質之間的遺傳距離（G D）變幅0～2.54。其中,L S73（麗水農家種）和L S82（金華農家種）,L S12（廣東早瓠瓜）和L S105（J 077-1 I 77①）,L S2（孝感瓠子）和L S11（蕭山圓蒲）,L S9（東陽農家種1）和L S103（08扁蒲-1）,L S25（武都瓠子）和L S61（花皮葫蘆分離種）的G D均接近0.00,說明它們的親緣關系極近。

從樹狀圖中并無明顯可作為分類標準的特性,但可以根據各種不同的趨勢,將96份瓠瓜種質材料在遺傳相似系數為0.68處分為8類（圖1）。第1類與其他材料相似性系數最小,僅有0.36,即與其他材料的距離最遠,僅有1份瓠瓜種質,即來自遼寧的小葫蘆,該材料瓜型為單腰且較小,瓜長僅10cm左右。第2類也只有1份種質,來自寧夏的臨夏瓠子,瓜型中長棒形,瓜色綠白,瓜條較長,早熟,該材料與其他材料相比地理來源較遠,親緣關系也較遠。第3類同樣只包括1份瓠瓜材料,為來自新疆的瓢葫蘆,瓜色淺綠,瓜型為長把梨形且較小,瓜長19cm左右,早熟。第4類包括3份材料,分別為來自浙江的全華蒲瓜、肖長蒲和杭州長瓜,瓜型均為長棒形,瓜色綠色,瓜長45～50cm,早熟。第5類共有9份材料,均表現為早熟,其中7份材料瓜色為綠白相間,而這7份材料中有5份材料的瓜型均為牛腿形,2份來自云南的材料也聚集在一起。第6類包括5份材料,分別為清秀、新蔡瓠瓜、麥瓠、南平青花插桿瓠、砧木。這組材料瓜色均表現為綠色,其中除砧木以外的4份材料瓜型為棒形,瓜長較短,早熟。第7類僅有1份材料,紹興長蒲,瓜型棒形,瓜色油綠,瓜條較長（41cm）,熟性較早。余下的75份材料被歸為第8類,以瓜型不同又可細分為3組,第1組瓜型為棒形（除腰葫蘆外）,包括8份材料,瓜皮綠色,瓜長中等（25～35cm）,早熟。第2組材料包括17份,瓜型多為牛腿形,近圓形有5份,占到近圓形材料總數的1/2；瓜色均表現為綠色,瓜長較短,熟期較晚,僅有的3份晚熟型的材料（火焰蒲、透年蒲和圓葫蘆）均聚集在本組。第3組包括50份材料,來源較廣泛,瓜型大部分為棒形,瓜色多變,以純綠色為主,本試驗中全部9份極早熟材料（蕭山園蒲、長蒲1、長蒲2、長蒲3、長蒲4、津勝特選、湖南圓瓠1號、觀賞瓠子分離種）均聚集在本組。

在主成分分析中,沒有明顯的可以作為分類標準的特征,材料較平均地分布于圖中,但相對于產地而言,相同瓜型的材料有聚集在一起的趨勢（圖2）。上窄下寬的牛腿形、長把梨形材料,大部分集中分布在圖左部和右上的位置；近圓形材料在圖上分布較分散,但大部分集中分布在中間靠左的位置；棒筒形材料最多,集中在圖中間部分,這與樹狀圖的結果基本一致。

表1 插入/缺失引物多態性分析

3 小結和討論

我國瓠瓜資源眾多,遺傳變異非常豐富,但較為全面、系統的遺傳多樣性分析還比較少見。應用分子標記技術研究分析主栽品種的親本與優良品系間的親緣關系,可為瓠瓜育種實踐中優化親本選配,減少雜交組合數目,提高品種質量及育種效率提供依據。通常,在闡明種質資源的遺傳多樣性后,選擇能最大程度代表物種遺傳多樣性的核心種質構成核心種質庫是長期整合、保存種質基因資源、方便育種親本選配的重要途徑。

插入/缺失標記是指兩親本間在全基因組序列中的差異,在生物的遺傳多樣性分析、純度鑒定、親子分析等方面已有廣泛的應用。然而,插入/缺失引物在蔬菜中應用較少,在瓜類中更加少見。本研究首次使用插入/缺失引物研究非模式物種---

瓠瓜的遺傳多樣性。Decker-Walters等［10］利用38個R A P D標記研究了世界范圍內74個瓠瓜品系的遺傳多樣性,發現世界范圍內瓠瓜可以大洲為界限劃為不同類群,非洲、亞洲的瓠瓜種質相對獨立,新大陸（美洲）的種質起源于非洲,但受到亞洲種質的一些影響,而商業品種由于地理起源和遺傳組成的差異有很大不同,由于這些品種的流通使得難以完整地界定某些品種。Y e t i s i r等［11］利用形態

學標記研究土耳其的182份瓠瓜的果實和種子材料,在統計學和多變量分析共同研究所得的數據基礎上,發現瓜型和大小可以作為區分瓠瓜亞類的主要標準,這與本研究的結論一致。

圖1 96份瓠瓜材料聚類分析樹狀圖

本研究利用插入/缺失標記方法,從分子水平上對我國96份瓠瓜資源的遺傳多樣性及親緣關系進行研究,可以為我國瓠瓜資源的合理開發利用以及進一步開展瓠瓜育種研究、指導親本選配提供重要依據；同時可為瓠瓜種質的分類、核心種質庫的構建,以及瓠瓜種質資源的進一步收集保存、創新利用提供分子水平上的依據,以縮短瓠瓜育種年限,提高育種效率。

圖2 96份瓠瓜材料插入/缺失聚類分析二維坐標圖

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（責任編輯：高 峻）

Q75文獻標志碼：A文章編號：0528-9017（2014）05-0668-05

2013-11-05

浙江省農業新品種選育專項（2012C 12903）

魯忠富（1963-）,男,浙江杭州人,實驗師,從事蔬菜育種及新品種推廣工作。E-mail：l z f 0522@163.com。

,李國景。E-mail：l ig j@m a i l.z a a s.a c.c n。

文獻著錄格式：魯忠富,王莎,吳曉花,等.利用插入/缺失標記分析我國瓠瓜資源遺傳多樣性［J］.浙江農業科學,2014（5）：668-672.