血管內皮生長因子165和肝細胞生長因子促心肌梗死后心肌細胞增生機制的研究*

錢雪松，安豐慧，劉普，陳波，李春堅，王連生，楊志健，陶正賢

血管內皮生長因子165和肝細胞生長因子促心肌梗死后心肌細胞增生機制的研究*

錢雪松**，安豐慧，劉普，陳波，李春堅，王連生，楊志健，陶正賢

目的: 探討血管內皮生長因子165（VEGF165） 和肝細胞生長因子（HGF）促進心肌梗死后心肌細胞增生機制的異同。

心肌梗死；血管內皮生長因子；肝細胞生長因子；增生

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:634.)

心肌梗死是一類嚴重威脅人類健康的急重癥。現有的治療手段，包括藥物治療、血管介入成形術和外科血管搭橋術，主要強調血運重建，而對心肌梗死后心肌細胞丟失和梗死后的心肌細胞丟失的補充并無“良方”。多種生長因子與心絞痛嚴重程度相關[1]，而血管內皮生長因子（VEGF）[2]、成纖維細胞生長因子[3]和肝細胞生長因子（HGF）[4]等能誘導梗死后心肌血管新生、抗心肌細胞凋亡而改善心臟功能，為心肌梗死提供了新的治療策略。

1 材料與方法

材料：心電監護儀：V24E，飛利浦；呼吸機：Newport E100m Ventilator， 美國紐邦醫療器械公司；氣管插管：塑料氣管插管（5.5，6.0，6.5，7.0，7.5），美國Sheridan公司；喉鏡：Kawe牌特制難度插管喉鏡，德國Kawe公司；無創傷縫針及無創傷滑線：帶雙頭針7-0聚丙烯（prolene）滑線；蛋白電泳儀、垂直電泳槽、轉移電泳槽（Mini Trans-Blot Cell型）均為美國Bio-RAD公司產品；BIO-RAD680型全自動酶標儀，美國Bio-RAD公司；BX51型正置熒光顯微鏡，日本Olympus公司；DP70型圖像采集系統，日本Olympus公司；門控單光子發射計算機成像儀（G-SPECT，ECAM+; Siemens， 德國）；99Tcm-甲氧基異丁基異腈（99Tcm-MIBI）：南京森科醫藥有限公司；EnSite NavX系統：St. Jude Medicine， Inc.，USA；注射導管：上海微創公司。抗體：單克隆大鼠抗Akt抗體（美國Santa Cruz公司）；單克隆兔抗磷酸化Akt抗體（美國Santa Cruz公司）；單克隆大鼠抗p21抗體（美國Santa Cruz公司）；單克隆大鼠抗p27抗體（美國Santa Cruz公司）；單克隆小鼠細胞周期蛋白A（Cyclin A）、Cyclin D1、 Cyclin D2、 Cyclin E（美國Sigma公司）；單克隆周期蛋白依賴性激酶（cdk）2、cdk4（美國Cell Signaling Technology公司）；單克隆小鼠抗β-actin抗體（美國Santa Cruz公司）；Protease inhibitor cocktail tablets（瑞士Roche公司）；Chemiluminescent Substrate kit（美國Pierce公司）。

方法：①載體構建：在本研究中，使用的 VEGF165、HGF均 為 人 VEGF165（human VEGF165， hVEGF）和HGF（human HGF， hHGF）。從人胎肝中抽提總RNA，并以該肝細胞總RNA為模版，利用合成的一對引物，采用RT-PCR技術獲得HGF基因的cDNA，并引入酶切位點。利用AD-EASYTM系統，構建HGF基因重組腺病毒載體（Ad- HGF）系統。將已引入酶切位點的HGF基因的cDNA，先轉入感受態質粒，再轉化大腸桿菌進行擴增，篩選陽性菌落，經酶切及測序，證實HGF基因已經正確轉入，再將該基因轉入pUC18質粒，pUC18質粒與AD-EASY質粒進行同源重組，用PacI酶切成線性化DNA，利用脂質胺轉染293細胞，經三輪擴增，制備高效表達Ad- HGF。同樣方法構建VEGF基因重組腺病毒載體（Ad-VEGF）。具體構建方法同前[5]。②動物模型構建和心肌注射：我們于2012-01至2013-01選擇雄性中華小型豬15頭，平均體重（36±2.6） kg，年齡3～4個月。所有實驗動物的管理均遵循中華人民共和國衛生部動物實驗管理條例和南京醫科大學實驗動物管理條例。術前禁食、禁水4小時。在誘導麻醉、氣管插管、開通靜脈通道和復合麻醉后，自下而上沿前正中線剪開胸骨，氬氣電刀電灼骨膜出血點，胸骨牽開器自正中撐開胸骨。暴露心包和肺臟。縱形切開心包，鈍性剝離心包，暴露心臟，并用7號手術線固定心包。顯露左前降支，于左前降支中遠端第二對角支處用無創針線7.0 prolene預結扎（不全部阻斷血流）10 min，然后結扎，構建心肌梗死模型。實驗動物分成3組：對照組（n=5）、Ad-VEGF組（n=5）、Ad-HGF組（n=5）。將溶解在1ml HEPES（pH=7.4）總量1×1010pfu的Ad-VEGF和Ad-HGF分別心肌局部注射到心肌梗死周圍區，注射分5點，相同劑量的生理鹽水注射到對照組。具體構建和心肌注射方法同前[5]。③心肌灌注和心臟功能檢測：治療前和治療后4周用G-SPECT檢測心肌灌注和心臟功能。靜注99Tcm-MIBI后60～90 min，行G-SPECT心肌灌注核素顯像。將左心室分為17個節段，左前降支分為7個節段[6]。采用5分評分法對各節段心肌的核素放射性分布進行評分[7]：0分：無分布；1分：分布嚴重降低；2分：分布減低；3分：分布輕度減低；4分：分布正常。正常左前降支為28分。采用GS Quant自動勾邊技術勾畫出垂直長軸和水平長軸的左心室舒張末期及收縮末期心腔輪廓，計算機三維擬合數學模型計算出左心室舒張末期容積（LVEDV）和左心室收縮末期容積（ LVESV），由公式算出左心室射血分數（ LVEF），LVEF=（LVEDV-LVESV）/LVEDV×100%。④蛋白免疫印跡（Western blotting）和免疫共沉淀（ IP）：在治療后4周，心肌灌注和心臟功能檢測后，取三組動物左心室正常心肌、梗死心肌、梗死移行區心肌，提取蛋白、電泳、轉膜、抗體孵育等，進行Western blotting和IP，具體檢測方法同前[5]。⑤免疫熒光檢測：在治療后4周，心肌灌注和心臟功能檢測后，取三組動物左心室正常心肌、梗死心肌、梗死移行區心肌，進行石蠟包埋、切片、抗體孵育等，進行免疫熒光檢測，檢測方法同前[5]。

統計學分析：每組經4次獨立實驗，數據用均數±標準差表示，用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析和t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

VEGF165和HGF在缺血心肌的表達：心肌治療4周后，通過免疫印跡法檢測VEGF和HGF的表達。結果顯示：在Ad-VEGF組（圖1A），心肌梗死區（I）和梗死周圍區（P）的VEGF表達分別為正常心肌（N）的2.21倍和2.18倍（P＜0.01），差異有統計學意義。而對照組心肌梗死區（I）和梗死周圍區（P）與正常心肌（N）VEGF表達差異無統計學意義（P＞0.05）；在Ad-HGF組（圖1B），心肌梗死區（I）和梗死周圍區（P）的HGF表達分別為正常心肌（N）的1.73倍和1.69倍（P＜0.01），差異有統計學意義。而對照組心肌梗死區（I）和梗死周圍區（P）與正常心肌（N）HGF表達差異無統計學意義（P＞0.05）。

VEGF165和HGF改善梗死后心臟功能和心肌灌注：治療前和治療后4周用G-SPECT檢測心肌灌注和心臟功能，結果顯示：Ad-VEGF組和Ad-HGF組心肌灌注（圖2A、2B）和左心室射血分數（圖2A、2C）治療后4周和治療前比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。

VEGF165和HGF促進梗死后心肌細胞增生：通過增值細胞核抗原（Ki67）和肌鈣蛋白T（Troponin T）熒光共染檢測VEGF165和HGF促進梗死后心肌細胞增生。如圖3所示，Ki67陽性細胞數、總細胞數、陽性細胞百分比在Ad-VEGF組分別為9.80±2.31/mm2、45.85±5.72/mm2、（21.78±6.3）%，在Ad-HGF組分別為9.20±3.43/mm2、46.70±7.99/ mm2、（19.72±6.31）%，在對照組分別為1.90±0.97/ mm2、22.30±6.86/mm2、（8.82±5.59）%。Ad-VEGF和Ad-HGF組的Ki67陽性細胞數、總細胞數、陽性細胞百分比分別與對照組比較差異均具有統計學意義（P均＜0.01）。

圖1 血管內皮生長因子165和肝細胞生長因子表達

圖2 三組在治療前后的心肌灌注和左心室射血分數比較

圖3 三組梗死后心肌細胞增生

VEGF165促進梗死后心肌細胞增生機制：為闡明VEGF165促進梗死后心肌細胞增生機制，通過免疫共沉淀分析梗死后心肌細胞增生途徑，如圖4所示，在Ad-VEGF組，細胞周期蛋白p21在梗死周圍區和梗死區表達分別與正常心肌比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；正常心肌細胞周期蛋白p27表達分別是梗死區和梗死周圍區2.23倍和2.90倍，差異均有統計學意義（P＜0.01），而梗死區心肌Cyclin D2、cdk4、Cyclin A、cdk2表達分別是正常心肌的1.61倍、3.02倍、3.06倍、2.16倍，梗死周圍區心肌Cyclin D2、cdk4、Cyclin A、cdk2表達分別是正常心肌的1.73倍、2.98倍、3.29倍和2.31倍，差異均具有統計學意義（P均＜0.01）。

HGF促進梗死后心肌細胞增生機制：為闡明HGF促進梗死后心肌細胞增生機制，通過免疫共沉淀分析梗死后心肌細胞增生途徑，如圖5所示，在Ad-HGF組，正常心肌p21表達分別是梗死區和梗死周圍區1.93和2.05倍、p27表達分別是梗死區和梗死周圍區的2.23和2.90倍，而梗死區心肌Cyclin A 、Cyclin E、cdk2表達分別是正常心肌1.94倍、1.93倍和2.11倍，而梗死周圍區心肌Cyclin A、Cyclin E、cdk2表達分別是正常心肌的2.14倍、2.01倍和2.09倍；梗死區和梗死周圍區心肌Cyclin D1表達分別是正常心肌 1.94和2.06倍，cdk4表達分別是正常心肌的2.08和1.99倍，差異均具有統計學意義（P均＜0.01）。

圖4 血管內皮生長因子165促進梗死后心肌細胞增生途徑情況

圖5 肝細胞生長因子促進梗死后心肌細胞增生途徑 。

3 討論

傳統觀點認為心肌細胞在出生后即向終末分化，不能夠復制，并且成年心肌組織中沒有儲存的心肌祖細胞，心肌損傷后心肌細胞不具有內源性再生能力，因此心肌受損后心肌細胞不能再生，被疤痕組織代替，最終導致心臟的收縮功能受損[8]。隨著干細胞和再生生物學的發展，這一傳統觀念引起越來越多的爭論和質疑。目前的研究表明，哺乳動物出生后心臟具有增生能力[9，10]。隨著心肌損傷后心肌組織具有再生能力資料的積累，如何促進心肌梗死后心肌細胞再生以補充丟失的心肌細胞，從而修復損傷心肌、恢復或改善心臟功能成為新的研究熱點。

目前，促心肌細胞新生研究主要集中在兩個方面：第一，通過干細胞定向分化修復心肌組織；第二，通過各種因子促進血管新生和心肌細胞新生修復心肌組織。然而外源性細胞治療心肌梗死面臨著來源、擴增、定向分化、移植后免疫反應、倫理學等諸多問題，因此內源性心肌細胞新生成為新的研究熱點。

多種因子促進心肌細胞增生已有報道。Engel等[11]用bFGF和p38抑制劑治療梗死心肌時發現，聯合應用bFGF和p38可促進心肌細胞增生。Nakajima 等[12]發現突變的p193和p53可使梗死后心肌重新進入細胞周期，促進心肌細胞增殖。Smart等[13]證實，胸腺素β4可促進血管新生和心肌細胞新生，并改善梗死后心臟功能。隨著研究的深入，越來越多的證據表明，通過多種細胞因子可促進心肌細胞增生。

本研究進一步證實，VEGF165和HGF可改善心肌梗死后心肌灌注和心臟功能，比較兩組實驗動物可知，VEGF165和HGF可對心肌梗死后心肌灌注和心臟功能改善程度上并無差異。同時也證實VEGF165和HGF可促心肌梗死后心肌細胞增生，但無論是Ki67陽性細胞數、總細胞數、Ki67陽性細胞數和總細胞百分比兩組間并無統計學差異，這可能是兩組實驗動物心臟功能改善無差異原因之一。

進一步研究發現VEGF165促心肌梗死后心肌細胞增生與Cyclin A和Cyclin D2/cdk4有關，而HGF促心肌梗死后心肌細胞增生與Cyclin A、Cyclin E和CyclinD1有關。Woo等[14]使用Cyclin A2處理缺血后心功能衰竭心臟，提示Cyclin A2促進心肌細胞再生，并改善心臟功能。Tamamor等[15]也發現Cycling D1和Skp2泛素鏈激酶可促進梗死后心功能衰竭心臟的心肌細胞增生。表明心肌細胞周期蛋白與心肌細胞增生有關。

為比較VEGF165和HGF可促心肌梗死后心肌細胞增生機制，本研究發現VEGF165通過p27途徑，而HGF通過p21和p27兩條途徑。無論是p21還是p27只有與Cyclin/cdk結合，才能通過細胞核，引起心包有絲分裂，促進心肌細胞增生。進一步研究發現，雖然VEGF165和HGF促心肌梗死后心肌細胞增生都與p27有關，但其下游途徑并不相同，VEGF165與Cyclin A/cdk2和Cyclin D2/cdk4有關，而 HGF與 Cyclin A/cdk2、Cyclin E/cdk2和 Cyclin D1/cdk4有關。

總之，本研究證實VEGF165和HGF可改善心肌梗死后心肌灌注和心臟功能，促進梗死心臟心肌細胞增生，但VEGF165和HGF促心肌細胞增生途徑不同。至于合用VEGF165和HGF是否可進一步增加梗死后心臟心肌細胞數量，減少心肌梗死面積，提高梗死后心肌灌注和心臟功能，有待于以后的實驗深入研究。

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VEGF 165 and HGF Improving Cardiomyocyte Proliferation in Experimental Porcine After Myocardial Infarction

QIAN Xue-song***, AN Feng-hui, LIU Pu, CHEN Bo, LI Chun-jian, WANG Lian-sheng, YANG Zhi-jian, TAO Zheng-xian.
Department of Cardiology, The People’s Hospital of Jiangsu Province, Nanjing (210029), Jiangsu, China

TAO Zheng-xian, Email: zxtao@njmu.edu.cn

Objective: To investigate the mechanism of vascular endothelial growth factor ( VEGF)165 and hepatocyte growth factor (HGF) improving cardiomyocyte proliferation in experimental porcine after myocardial infarction (MI).Methods: The MI model was established by left anterior descending artery ligation in 15 male pigs and the animals were divided into 3 groups, n=5 in each group. Control group, the pigs received normal saline injection at the infarct and peri-infarct zones. VEGF group, the pigs received (1×1010) pfu of viral titers of Ad-VEGF injection. HGF group, the pigs received (1×1010) pfu of viral titers of Ad-HGF injection. The myocardial perfusion and cardiac function were examined by SPECT, the protein expressions of VEGF165 and HGF were measured by Western blot analysis, cardiomyocyte proliferation was analyzed by immunof l uorescence and immunoprecipitation method.Results:① Compared with Control group, the expressions of VEGF165 and HGF were higher at the infarct and peri-infarct zones in both treatment groups;② Both treatment groups had better cardiac function and myocardial perfusion;③ Both treatment groups had improved cardiomyocyte proliferation at the infarct and peri-infarct zones.④VEGF165 promoted cardiomyocyte proliferation via p27 pathway; ⑤HGF promoted cardiomyocyte proliferation via p21 and p27 pathways.Conclusion: VEGF165 and HGF could improve myocardial perfusion and function in experimental porcine afterMI, VEGF165 and HGF promote cardiomyocyte proliferation via different pathways.

Myocardial infarction; Vascular endothelial growth factor; Hepatocyte growth factor; Proliferation

2013- 03-28）

（編輯: 汪碧蓉）

江蘇省自然科學基金（BK2010021）；國家自然科學基金（81170102）；江蘇省高校“青藍工程”科技創新團隊帶頭人科研項目（JX2161015030）

210029 江蘇省南京市，江蘇省人民醫院 心臟科（錢雪松、陳波、李春堅、王連生、楊志健、陶 正賢）；伊犁州友誼醫院 心臟科（安豐慧、劉普）

錢雪松 副主任醫師 學士**現在張家港市第一人民醫院 心臟科***Now working in The First People's Hospital of Zhangjiagang

陶正賢 Email: zxtao@njmu.edu.cn

R445.1

A

1000-3614( 2014 ) 08-0634-05

10.3969/j. issn. 1000-3614. 2014.08.019

方法:將15頭雄性中華小型豬結扎冠狀動脈左前降支構建心肌梗死模型。實驗動物分成三組：對照組、VEGF基因重組腺病毒載體組（Ad-VEGF組）、HGF基因重組腺病毒載體組（Ad- HGF組） ，每組5只。將1×1010pfu的Ad-VEGF和Ad-HGF分別局部注射到Ad-VEGF組和Ad- HGF組豬的心肌梗死周圍區，相同劑量的生理鹽水注射到對照組。通過門控單光子發射計算機成像儀檢測心肌灌注和心臟功能，通過免疫印跡法檢測VEGF165和HGF在心肌的表達，采用免疫熒光雙染和免疫共沉淀分析心肌細胞增生。

結果: ①在Ad-VEGF組，心肌梗死區和梗死周圍區的VEGF165表達明顯高于正常心肌（P＜0.01）；在Ad-HGF組，心肌梗死區和梗死周圍區的HGF表達明顯高于正常心肌（P＜0.01）。②高表達的VEGF165和HGF改善梗死后心肌灌注和心臟功能。③VEGF165和HGF可促進梗死區和梗死周圍區心肌細胞增生。④VEGF165通過 p27促心肌細胞增生。⑤HGF通過 p21和p27促心肌細胞增生。

結論: VEGF165和HGF改善梗死后心肌灌注和心臟功能，促心肌細胞增生，但VEGF165和HGF促心肌細胞增生途徑不同。