鏈霉菌產生的抗血栓活性物質研究進展

杜迎翔，賀麗英，程廣艷，孔 毅*(.中國藥科大學分析化學教研室，南京 0009；.中國藥科大學生命科學與技術學院，南京 0009)

急性心肌梗死、高血壓、冠心病、先天性心臟疾病和心臟衰竭等心血管疾病是造成全球人口死亡的主要原因之一[1]。世界衛生組織(WHO)預測，截止到2030年，每年將會有2 300萬人死于心血管疾病[2]。早在1980年，De Wood采用鏈激酶靜脈滴注的方法治療早期的急性心肌梗死，從而降低了急性心肌梗死患者的死亡率，確立了溶栓藥物在心血管疾病治療中的地位[3]。

臨床所使用的溶栓藥物具有價格昂貴、較低的纖維蛋白特異性、半衰期較短、伴隨出血危險、易引發變態反應等缺點[4-6]，因此亟待開發更加安全有效的新型抗血栓藥物。目前研究人員主要進行兩方面的工作，一方面是利用基因工程和單克隆抗體技術對現有的抗血栓藥物進行改造，降低其產生的不良反應，使其達到更好的臨床應用效果；另一方面是篩選新型的天然來源的溶栓藥物。微生物種類繁多，生長周期短，易于大量培養，其代謝產物結構多樣，生物活性豐富。因此，微生物來源的抗血栓活性物質具有極高的研究價值。本文對來源于鏈霉菌的抗血栓活性物質進行了簡單地綜述。

1 血栓形成的機制

血栓是血液流動的過程中，在血管或心臟內膜的表面形成的一種病理性的、非均勻性的半凝塊狀物質，它的主要成分是纖維蛋白[7]。人體血液中存在相互拮抗的凝血系統和抗凝血系統(也稱纖維蛋白溶解系統)，當纖維蛋白溶解系統的功能降低時，凝血與抗凝血功能就會失去平衡，引起血栓形成[8]。

2 抗血栓藥物

目前，臨床上常用于血栓性疾病防治的藥物主要為抗血小板類藥物、抗凝血類藥物和溶血栓藥物[9]，前兩類藥物用于防治動靜脈血栓的形成，后一類用于溶解血栓。

在哺乳動物血液中存在擔當溶解血栓作用的纖溶系統，纖溶過程包括2個基本過程：其一是在纖溶酶原激活劑(PA)的作用下，纖溶酶原(Pg)轉變成纖溶酶(Pm)，纖溶酶可以將血凝塊上的不溶性纖維蛋白降解為可溶性的產物，從而溶解血栓；其二是纖溶酶直接作用于纖維蛋白(原)，使其降解，溶解血栓。目前，臨床上常用的溶栓藥物主要為纖溶酶原激活劑，如鏈激酶(SK)、尿激酶(UK)、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)等[10]。

3 從鏈霉菌中發現的抗血栓活性物質

鏈霉菌屬于放線菌目的一科，是一類在自然界中廣泛存在的微生物，多見于土壤中。絕大多數的鏈霉菌對人體是無害的，大部分鏈霉菌能夠分泌多種蛋白質(如蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶等)，大多數抗生素也是由鏈霉菌產生的，在放線菌產生的生物活性物質中，以鏈霉菌屬居首，高達8 366余種[11]。

已報道的從鏈霉菌中發現的抗血栓活性物質大部分為溶栓劑。從作用機制上微生物來源的溶栓劑分為兩類：一類是纖溶酶原激活劑，如鏈激酶(SK)、葡激酶(SaK)，其作用機制是激活纖溶酶原轉變為纖溶酶，纖溶酶具有絲氨酸蛋白酶的活性，可以降解構成血栓骨架的纖維蛋白，起到溶解血栓的作用；另一類是纖溶酶類物質，其機制是直接作用于血塊中的纖維蛋白(原)，使血栓溶解，來源于芽孢枯草桿菌的納豆激酶[12](NK)以及來源于鏈霉菌、芽孢桿菌、糞鏈球菌、鐮刀菌等的纖溶活性物質的作用機制多屬于此類。

3.1鏈霉菌產生的抗凝活性物質 劉華珍等[13]從鏈霉菌S-254發酵液中篩選了一種凝血酶抑制劑，為多組分小肽化合物，其組成結構為R-X-X-Argininal，X為氨基酸殘基，R為丙酰基或丁酰基，是一種能直接作用于人體凝血機制中最關鍵的酶——人凝血酶的抗凝活性物，與有關的抗凝劑相比，S-254凝血酶抑制劑的活性更強。S-254對人凝血酶顯示出的明顯抑制作用不僅體現在體外實驗中，在動物體內也顯示出良好的抗凝血、抗血栓形成和抗血小板聚集的作用，此研究將為深入研究凝血酶提供有利的途徑并在實際的應用中開拓出新的前景。

3.2鏈霉菌產生的溶栓活性物質 人血液中存在的纖溶酶和纖溶酶原激活劑都是絲氨酸類蛋白酶，而鏈霉菌分泌產生的多種活性蛋白酶中，很多也屬于絲氨酸類蛋白酶家族，所以從鏈霉菌中篩選新型的天然來源的抗血栓藥物具有誘人的前景。1996年，法國科學家報道了一種從鏈霉菌的發酵液中分離純化到的具有纖溶活性的蛋白酶[14]，之后陸續有研究人員從鏈霉菌中發現新的具有纖溶活性的蛋白酶。

3.2.1鏈霉菌產生的具有纖溶酶活性的物質 王駿等[15]報道了從一株云南土壤篩選出的鏈霉菌Y405的發酵液中獲得了一種具有纖溶活性的蛋白酶SW-1。SW-1是單肽鏈蛋白，相對分子質量為30 kDa，等電點為8.5，其纖溶活性在4～37 ℃、pH4.0～9.0具有較好的穩定性，最適pH為8.0。該酶對絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF和金屬離子螯合劑EDTA都較為敏感，N端17個氨基酸序列為R/N/F-P/D-G-M-T-M-T-A-I-A-N-Q-N-T-Q-I-N-，N端第一和第二殘基具有不均一性。SW-1是一種纖溶酶，可以直接降解纖維蛋白和纖維蛋白原，但其對纖維蛋白的特異性不高，可能引起系統性纖溶，造成其在使用上具有一定的局限性，目前研究人員正在利用基因工程的方法改造相應的基因sqr-1。

Chitte R R等[16]從一株嗜熱鏈霉菌SD5發酵液中純化出一種強纖維蛋白特異性的纖溶酶actinokinase，該酶產生的最佳pH為8.0，溫度為55 ℃。actinokinase為絲氨酸蛋白酶，纖溶活性具有N端依賴性，相對分子質量為35 kDa，在37～60 ℃、pH6～9范圍內，它的纖溶活性都比較穩定。actinokinase能夠直接把纖維蛋白降解為小分子產物，與鏈激酶和尿激酶相比，actinokinase能夠快速溶解血凝塊。actinokinase基因已在大腸桿菌中進行了克隆和表達，美國和印度專利局對利用嗜熱鏈霉菌SD5和它的突變體產生纖溶酶的過程授予了專利[17]，actinokinase可能會成為一種有前景的治療心肌梗死的藥物。

鞠秀云等[18]從鏈霉菌XZNUM00004發酵液中分離純化到纖溶酶SFE1，SDS-PAGE電泳顯示，該酶的相對分子質量為20 kDa，在pH5～8和低于65 ℃條件下穩定，最適宜pH和最適溫度分別為7.8和35 ℃，N端15個氨基酸序列為A-P-I-T-L-S-Q-G-H-V-D-V-V-D-I-。SFE1纖溶酶活性高，同時具有耐熱的優點，將酶加熱到65 ℃仍能保留85%的活性。PMSF可以強烈抑制SFE1的活性，表明該酶屬于絲氨酸類蛋白酶，EDTA和EGTA能夠部分抑制其活性。SFE1能夠首先快速水解纖維蛋白原的Aα-鏈，緊接著水解Bβ-和γ-鏈。該酶對研究從鏈霉菌中得到新型高效的溶栓藥物是一個有益的探索。

Mander P和Simkhada J R等[19-21]分別從3株鏈霉菌菌株CS624、CS684和CS628發酵液中純化得到3種單肽鏈纖溶酶FES624、FP84和FP28。這3種蛋白酶N端的15個氨基酸序列各不相同，是3種不同的纖溶酶。其中FP28是目前為止報道的鏈霉菌產生的相對分子質量最小的纖溶酶，其相對分子質量為17.6 kDa。FES624相對分子質量與FP28相近，為18 kDa，兩者的N端氨基酸序列有33%相同，但纖維蛋白平板實驗表明，FP28的活性比FES624好。FP28與FP84(35KDa)相對分子質量相差較大，兩者均可降解纖維蛋白原，但FP84只能水解纖維蛋白原的Bβ-鏈，而FP28可以在2 h內水解纖維蛋白原的3條鏈Aα-、Bβ-和γ-。體外動物實驗表明，FP28具有很好的抗血栓活性，在未來可能會成為一種有前景的溶栓藥物。

蔡尤佳[22]研究表明，一株嗜酸放線菌701的發酵液具有較強的抗凝、溶栓活性，嗜酸放線菌屬于放線菌中的鏈霉菌屬。對該菌株的發酵條件進行優化，提高了發酵液的溶栓活性，為開發新型的血栓防治藥物的擴大工藝研究提供了參考。

3.2.2鏈霉菌產生的同時具有纖溶酶活性和纖溶酶原激活劑活性的物質 Uesugi Y等[23]從鏈霉菌中發現了一種高活性的絲氨酸蛋白酶SOT，與已知的纖溶酶和纖溶酶原激活劑等相比，SOT具有很高的纖溶活性。體外實驗結果表明，SOT的纖溶活性是纖溶酶的18倍，纖維蛋白平板實驗結果顯示，SOT的活性可與t-PA相媲美，SOT也具有纖溶酶原激活劑活性。與納豆激酶相比，SOT能夠迅速水解纖維蛋白原的Aα-和Bβ-鏈，兩者對纖維蛋白和纖維蛋白原降解模式各不相同，但具有纖溶協同效應。研究表明，SOT可作為一種有效的溶栓劑用來預防和治療血栓。

武臨專等[24]對鏈霉菌C-3662的發酵上清液進行分離純化，得到了一種具有纖溶活性的蛋白酶CGW-3。CGW-3為一單肽鏈蛋白，相對分子質量22.72 kDa，等電點為9.0，纖溶活性的最適pH為7.5～8.0，對溫度比較敏感。該酶對絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF敏感，對EDTA不敏感；其N端15個氨基酸的序列為V-V-G-G-T-R-A-A-Q-G-E-F-P-F-M-，與微生物來源的胰蛋白酶類絲氨酸蛋白酶具有較高的同源性。CGW-3具有纖溶酶活性，可以直接降解纖維蛋白，也可以作為纖溶酶原激活劑，起到溶解血栓的作用。初步動物實驗結果表明，在大鼠體內蛋白酶CGW-3的溶栓效果要優于尿激酶。

4 結語

近年來，隨著對血栓疾病的深入研究，尋找和研制效果好、不良反應小的抗血栓藥物對人類健康具有十分重要的意義。目前報道的從鏈霉菌中發現的絲氨酸類蛋白酶，其活性與臨床上使用的溶栓藥物相比，具有很大的優越性，而且鏈霉菌的生長速度快，生長條件易于控制，可以通過控制人工發酵條件對目的產物進行批量生產。綜上所述，對從鏈霉菌中發現的抗血栓活性物質的進一步研究，將會使臨床使用這類溶栓劑具有廣闊的前景。

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