HE制片技術的標準化初步探討

宋蜀伶,潘鑫艷,王 力

HE制片技術的標準化初步探討

宋蜀伶,潘鑫艷,王 力

HE染色；制片；標準化；管理

隨著科技的發展,許多新技術和新方法源源不斷地融入到傳統的病理技術當中,如分子病理技術、組織芯片、圖像分析技術、顯微切割和遠程病理技術等。但是,HE常規制片技術作為病理學的重要組成部分,仍然是臨床病理診斷工作中最基本、最重要的技術手段,廣泛地應用于臨床、教學和科研工作中。HE制片技術的發展有100多年的歷史,HE切片診斷工作在一些大中醫院相繼展開,有關疾病診斷方面的WHO標準日趨成熟,但在HE制片技術的標準化方面,目前全球還沒有統一的標準。各家醫療機構HE制片方法五花八門,制片質量參差不齊,嚴重影響了病理診斷的準確率和及時率。因此,加強醫療機構HE制片技術的標準化管理,對提升醫院的整體醫療水平具有重要意義。筆者參考有關病理技術的相關報道,結合多年的工作經驗,就HE制片過程中的主要環節,對HE制片技術的標準化進行了初步探討。

1 固定

組織固定是HE制片的第一步。組織離體后應立即固定,組織固定時間因固定液種類、組織種類、大小、質地、有無包膜等而異。組織固定溫度一般控制在37 ℃以下,組織固定溫度越高,固定時間越短。對于一般組織,若材塊體積在2 cm×2 cm×0.5 cm范圍內,可按固定液每小時滲透組織2 mm估算固定時間。對于較大的標本,應沿最大剖面每隔0.5～2.0 cm切開,分開或中間夾隔離物固定。空腔臟器應沿長軸剪開,平鋪固定于支持物上,再放入固定液中固定。對于有包膜、類球形組織,應將組織切成片狀,有利于快速固定。

固定液的選擇應根據組織的成分而定,在目前還沒有實現組織個性化固定的情況下,提倡用10%中性福爾馬林固定組織。固定液體積應為所固定組織的10～20倍。

2 取材

應根據組織的構成、病變組織的范圍及觀察目的等確定取材的大小和數量,直徑<0.5 cm的標本,要用濾紙或拭鏡紙等包裹,并在組織上滴加1～2滴伊紅染液以便包埋和切片；復雜標本要多部位取材,上、下、左、右、中間、瘤組織與正常組織的交界均應取材,所取組織塊應大小適中、厚薄均勻、形狀規則,取材體積不應大于1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm。

取材時要保持取材刀的鋒利,切割組織時避免用力下壓取材刀或來回拖拉取材刀,用鑷子夾取組織時動作要輕柔,以免組織擠壓嚴重而發生變性影響診斷。取材要注意組織或器官的連續性或完整性,皮膚要帶有表皮和真皮,腸壁和胃壁要有黏膜和肌層,腎臟要有皮質和髓質等[1]。對于骨組織或鈣化組織,待組織脫鈣充分后(細針無阻力扎透)即可取材,用流水沖洗>0.5 h或浸入10%碳酸鈉溶解0.5 h以除去組織間殘留酸液,方可進入下一程序。取材時要剔除組織周圍無診斷意義的脂肪及標本中殘留的手術線等異物,脂肪過多,易引起組織脫水、浸蠟不充分,導致切片困難。取材時大小淋巴結均應剖開,避免因其包膜阻隔引起脫水和浸蠟不良。

3 脫水

脫水時間對HE質量至關重要,脫水時間除與組織的大小、種類和質地等直接相關外,還與脫水劑的質量及環境溫度、濕度等有關。一般來說,對于相同或相近的組織,小組織比大組織的脫水時間要短,小個體比大個體的脫水時間要短。但現實情況是,大多數醫療機構都無法做到大小標本分別或分開脫水,而是將各種標本混裝在一個或幾個脫水機中,以相同的程序完成脫水。這樣就容易造成小標本過度脫水,引起組織過脆、過硬,切片時易破碎及跳刀,不能切出完整蠟膜；大標本脫水不充分,造成透明欠佳,浸蠟不好,組織柔軟無法制片。

因此,大小標本應分開脫水。另外還要熟悉各種組織的脫水特性,肝、脾、腦、腎、淋巴結等組織脫水時間要短；乳腺、網膜、皮膚等含脂肪多的標本要適當延長脫水時間。對于不能實現全自動脫水的醫療單位,還要注意脫水劑的溫度及空氣濕度對脫水的影響,溫度高有利于組織脫水,溫度過低可延長組織脫水時間,雨季或潮濕季節也要適當延長脫水時間。脫水劑要定期或定量更換,應根據脫水劑的容量和每天標本的數量,計算出更換脫水劑的時間。

透明時間因組織的大小、種類和質地而異,此外,還與透明劑質量及試劑溫度等有關。提高透明溫度可縮短透明時間,但當溫度高于活體體溫時,容易造成組織發脆。透明時間過長或透過溫度過高都會引起組織變脆變硬,造成后制片困難。透明時間控制在90 min以內,透明溫度不要超過40 ℃。應定期更換透明試劑,保證透明質量。

4 浸蠟

浸蠟一般要經多級步驟才能完成,第一級石蠟要用軟蠟,后面幾級用硬蠟。浸蠟溫度不要太高,一般高于所用石蠟溫度1～2 ℃為宜。浸蠟所用石蠟質量要有保證,不要含有過多雜質,雜質過多會污染切片,損害切片刀片,造成切片劃痕增多,影響制片質量。對于質量不定的石蠟,購入后可用水煮沸以盡量去除雜質。

浸蠟溫度和時間對浸蠟過程影響較大,溫度過高或時間過長,組織會收縮變硬變脆；溫度過低或時間過短,組織浸蠟不充分,組織缺乏硬度,不利于制片。浸蠟溫度一般在62 ℃左右,浸蠟時間不要超過3 h。

5 包埋

包埋所用石蠟應和最后一級浸蠟的石蠟相同,包埋的蠟溫應高于石蠟熔點2～4 ℃。一般來說,組織的硬度最好能和包埋時所用石蠟的硬度一致,便于切片。包埋時應根據組織的特性和診斷需要將組織按一定規律排列。一般將組織的最大面或病灶面朝下包埋,不平整的組織要用鑷子輕輕壓平以保持組織切面的完整,但有時病灶面比組織的最大面更有意義；大小不一的組織同時包埋在一個蠟塊中時,按組織從大到小依次包埋,并確保每個組織的最大面在一個平面上；管腔組織、乳頭狀組織、皮膚及囊壁等組織要豎立包埋,以保證鏡檢時能觀察到各層組織結構。

6 切片

切片是HE制片質量較為關鍵的一環,切片前的蠟塊預處理對制片質量影響較大[1]。我科在修片后用冰水混合物處理組織,與常規冷凍處理蠟塊方法相比,對那些脫水或透明過度、脫水或浸蠟不足的組織,前者制片效果明顯優于后者。切片時要均勻用力,用力過大、速度過快都會導致切片厚薄不均。軟的組織切片速度稍慢；較硬的組織切片速度稍快。切片時還應注意蠟塊中組織結構的層次和方向,一般來說,組織中纖維、肌肉等的走向應與切片刀平行,質地較硬的部分應放在上面,如皮膚的表皮、腫塊的包膜、胃腸道的漿膜等,這樣可以減少組織破碎、斷裂、厚薄不均等現象。

對于長徑≤3 mm的細小組織,如大部分內鏡、穿刺標本,組織切面數要在8個以上。對于脫鈣組織、鈣化組織和硬化組織等,切片前要提前挑出,放在最后切片,以延長切片刀的使用壽命。切面厚度控制在3～6 μm。對于細胞成分較多的組織,如淋巴結等,切得要薄一些,細胞成分較少的組織,如脂肪組織等,切得稍厚一些。

7 撈片

撈片時應注意“定位”和“定向”[2]。“定位”就是把蠟膜附貼在玻片的固定位置,一般將蠟膜附貼在玻片上除去標簽位置后剩余部分的中間位置。對于方形、長條形組織和連續切片的小組織,應使方形組織的四邊盡量與玻片四邊平行,長條形組織、小組織的蠟膜也應與玻片兩長邊平行。這樣做一方面使切片看上去整齊、美觀；另一方面,鏡檢時減少載物臺上移動器的位移范圍,節省操作時間。“定向”就是組織在玻片上的排列要有一定的方向,如皮膚組織切片的表皮層端朝下,管腔類組織切片的黏膜或內膜端朝下,實性組織切片的被膜端朝下,鏡檢時觀察到的組織圖像就會倒轉過來,變成表皮層端朝上、黏膜端朝上、被膜端朝上,符合一般人的視覺習慣。另外,撈片時要注意把握好撈片時機和撈片方向,當蠟膜皺折完全展開,組織塊沒有明顯擴張時,即可撈片；撈片方向是指撈片時玻片和蠟膜所成的角度,正確的做法是,將玻片沿蠟模一端垂直插入,使蠟模一端與玻片接觸后快速而輕盈地提起,輕輕甩去蠟模與玻片間的水分,或將玻片豎立放置片刻,待不再有水分流下后即可烤片。

8 染色

染色前切片要進行烤片和脫蠟,一般在60～65 ℃溫箱內烤片30～60 min,不要將切片水平放在烤片機上高溫烘烤,這樣會導致切片內的小水滴暴沸將組織撐開。脫蠟時間寧長勿短,要根據脫蠟切片的數量定期更換脫蠟試劑,一般來說,兩缸各400 ml的二甲苯可以供500張切片脫蠟。加熱和增加振蕩時間可縮短脫蠟時間。切片染色前保證脫蠟和水化充分,否則染色后會出現片狀或點狀灰白色區域或染色不均區域。蘇木精和伊紅的染液質量對染色效果影響較大,其中蘇木精和伊紅染液的pH值是影響其染液質量最重要的因素之一。保持染液的pH值在2.5左右,對保障蘇木精和伊紅染液的染色效果至關重要[3-4]。另外,要把握好蘇木精和伊紅染畢后的分化力度,分化時間要根據分化液的質量、切片染色情況等靈活掌握。分化時要充分考慮到核漿對比和切片的長期保存。染色完成后,要進行充分水洗,以除去組織中殘存的酸或堿,以便切片長久保存而不褪色。

9 封固

封片要提倡濕封,干封會引起細胞收縮、龜裂或切片出現黑色結晶樣小點,影響細胞折光率改變和觀察效果。封片時一是要掌握好中性樹膠的濃度和量的多少,濃度太稀膠易溢出玻片,切片保存一段時間后二甲苯揮發,組織中會產生空隙,不利切片保存；濃度過高膠過稠散不開,易形成氣泡。膠的濃度為一秒鐘滴下一滴為宜。二是要掌握蓋片時的速度和角度,取蓋玻片時要輕拿輕放,以小于30°角度接觸玻片的側邊,輕輕放下,不要垂直放下,以免產生氣泡。

綜上所述,HE制片過程環節較多,每一個環節都有相應的質控要求和技術標準,但要做到國際和國內的統一,還有相當長的路要走。但每一個制度或標準的建立都要經歷從無到有、從少到多、從不完善到逐步完善的過程。在日常的HE制片過程中,技術人員要不斷探索,勇于創新,認真總結經驗,為HE切片質量的標準化、規范化建設多做貢獻。

[1] 孫琪.病理切片質量控制的體會[J].寧夏醫學院學報,2003,2(6):444-445.

[2] 凌啟波,梁英杰.HE制片質控要求[J].臨床與實驗病理學雜志,2000,16(4):333-334.

[3] 王力,楊舉倫,趙穩興,等.Ehrlich 蘇木精染液pH 值變化對組織染色的影響[J].解放軍醫藥雜志,2011,23(3):24-26.

[4] 王力,楊舉倫,趙穩興,等.改良Ehrlich 蘇木精染液在HE 染色中的應用[J].臨床與實驗病理學雜,2011,27(8):902-903.

650032 昆明,成都軍區昆明總醫院病理科

王 力,E-mail：tlzj.hh@163.com

R 361

A

1004-0188(2014)09-1035-02

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.09.048

2014-07-29)