表觀遺傳學在前列腺癌靶向治療中的研究進展

馬寶杰(綜述), 牛遠杰(審校)

(天津醫科大學第二醫院泌尿外科 天津市泌尿外科研究所，天津 300211)

腫瘤中遺傳信息的改變，一般包括基因的變化和表觀遺傳學的改變，并且這些改變都是可遺傳的。表觀遺傳學包括DNA甲基化，組蛋白乙酰化，蛋白的磷酸化、泛素化以及核小體重構和非編碼RNA相關的調控等。基因的變化通常是不可逆的，然而，表觀遺傳學的改變不會改變DNA代碼，并且是可逆的改變。因此，使用多種手段將腫瘤表觀遺傳學中的改變逆向轉變，是一種治療的可能性。

前列腺癌是歐美發病率最高的腫瘤，我國前列腺癌發病率也呈明顯上升趨勢；雖然目前的醫學研究進展能治療局限性的前列腺癌，但對于激素抵抗性或者晚期前列腺癌還缺乏有效的治療手段，因此進一步研究其發病機制尤其是表觀遺傳學非常必要[1]。以藥物開發為目標的前列腺癌細胞表觀基因所取得的進展，尤其強調在該領域的新方向進行如下綜述。

1 在前列腺癌中的表觀遺傳學改變

1.1概述 表觀遺傳參與了前列腺癌發生、發展及轉移等的各個階段，其中DNA甲基化和組蛋白修飾在前列腺癌機制中的作用尤為重要[1-2]：DNA異常甲基化和前列腺癌DNA損傷修復、激素應答、侵襲和轉移密切相關；而組蛋白修飾異常則引起相應染色體結構和基因轉錄調控的改變。目前已有針對前列腺癌DNA甲基化轉移酶和組蛋白去乙酰化酶的抑制劑，經臨床驗證療效尚佳，這也提示針對前列腺癌表觀遺傳學變化的治療有著廣泛的應用前景[1]。

1.2前列腺癌中的DNA甲基化改變 DNA甲基化是指生物體在DNA甲基轉移酶 (DNA methyltransferase，DMT) 的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉移到特定的堿基上的過程，在哺乳動物中其主要發生在5′-CpG-3′的C上生成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化能沉默相關基因的表達，而去甲基化則能誘導相關基因的激活。有研究報道，在前列腺癌中存在多種形式的甲基化水平的改變；其中，較常見的真核基因生化改變是CpG二核苷酸胞嘧啶殘基的甲基化，而1%左右的人類DNA中含有的短CpG序列稱為CpG島[1-2]。CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基甲基化是真核DNA的共同生化修改：成人基因組中60%～90%的CpG二核苷酸發生甲基化，引起自發脫氨基作用，從而導致5′-甲基胞嘧啶轉變為胸腺嘧啶[2-4]。在過去，CpG二核苷酸被認為是DMT的初始靶點；但是，2009年出版的人類第一個完整的“DNA甲基化圖”挑戰了這一觀點；并且，在胚胎干細胞中發生高甲基化的位點并非是含CpG的胞嘧啶[1-4]。大多數CpG的甲基化發生在基因內和基因間的非編碼區域，這些區域被認為能促進細胞上游分子調節其下游分子；而啟動子相關CpG島通常不會發生甲基化，但顯性基因除外[1-4]。啟動子的甲基化能直接和間接地抑制轉錄起始，這種作用是通過結合組蛋白去乙酰酶抑制劑和染色質重構相關因子，帶來凝結的染色質結構干擾啟動子轉錄酶的正常作用，從而吸引CpG 甲基化位點區域的蛋白質來實現的[1]。另外，核小體定位可能也對甲基化產生較大的影響[1]。

目前的許多研究已充分認識到，前列腺癌中啟動子高甲基化的作用非常重要[2-4]。因為這種修改能沉默許多經典的腫瘤抑制基因，包括腺瘤性結腸息肉病(adenomatous polyposis coli,APC)基因和Ras相關區域家族1(Ras-association domain family 1,RASSF1)，以及雄激素和雌激素受體基因，細胞黏附基因(CD44和CDH1)，細胞周期控制基因(CCND、CDKN1B和SFN)和凋亡基因(PYCARD、RPRM和GLIPR1)等[1-4]。在這些基因中，尤其是GSTP1基因，已經有非常明確的證據證實其啟動子區的甲基化導致其基因表達的沉默，這種現象在90%以上的前列腺癌和75%以上的侵襲前高級別的前列腺上皮內瘤變中均廣泛存在，甚至在一定程度上被作為診斷前列腺癌的分子標記[1-4]。

高甲基化發生在早期前列腺癌，但更廣泛地發生在轉移性前列腺癌上[1-4]。基因組的甲基化改變與腫瘤分級、Gleason評分≥7以及諸如基因GSTP1、RARB、APC、PYCARD、PTGS2、ABCB1和RASSF1啟動子區的甲基化水平密切相關。

DMT在DNA甲基化過程中起著非常關鍵的作用，并且在甲基化遺傳過程中也發揮重要作用[1]。DMT主要包括3類，分別是DMT1、DMT2、DMT3A和DMT3B：其中DMT1主要起維持DNA甲基化的作用，這種作用是DMT1通過增加S期的細胞周期增殖細胞核抗原和E3泛素化蛋白連接酶(一種關鍵的有絲分裂遺傳基因組甲基化模式的組蛋白結合酶)來實現的；DNA復制后，DNMT1 通過甲基化新的DNA合成鏈，從而將這種甲基化遺傳下去；DMT2與DNA特異位點結合的作用和機制目前還不清楚；DMT3a和DMT3b能使去甲基化的CpG位點重新甲基化，即參與DNA的從頭甲基化[1]。有證據表明，DMT3B和DMT1在腫瘤細胞中的聯合作用能起到維持DNA甲基化和相關基因沉默的作用[1]。DMT也可通過招募組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)和其他染色質相關的組蛋白到啟動子區域來抑制轉錄，這種作用是依賴于甲基轉移酶的活性的。DMT和HDAC結構上的相關性可能產生了一種維持基因沉默的輔助作用：促進HDAC綁定復制叉(其作用是確保在每一次的細胞分裂中新組裝的核小體包含低乙酰化的組蛋白)。因為DMT是優先作用于細胞核內的DNA，所以細胞核內DNA比核外DNA甲基化程度要高[5]。此外，有研究報道，核小體DNA有更高度的DNA甲基化[2-4]。

1.3前列腺癌中的組蛋白乙酰化改變 組蛋白是指能結合下游DNA的蛋白，其在信號通路和機制研究中的作用舉足輕重。組蛋白能調控和其結合的DNA的表達和其甲基化等的改變，組蛋白的N端尾巴伸出核小體之外，由于其富含正電荷氨基酸故受到各種可逆的轉錄后修飾。這些修飾包括乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化、poly-ADP核糖基化、類泛素化、羰基化和糖基化，但其中許多修飾的方式在腫瘤發展中的作用還不得而知。組蛋白乙酰化和前列腺癌的關系密切，目前研究多報道在前列腺癌中組蛋白乙酰化水平升高[1，6]：其修飾的異常可引起相應染色體結構和基因轉錄調控的改變，影響細胞分化和凋亡，導致前列腺癌的發生。

在雄激素受體的調控中乙酰化很常見，雄激素受體通過影響相關乙酰化酶來激活或者抑制其下游相關基因，其中被激活的因子包括KAT2B、KAT5、NCOA1和EP300等[1]。并且，HDAC1、HDAC2、HDAC3和siRT1能下調雄激素受體的表達；但與此矛盾的是，在50%～70%的前列腺癌中HDAC1和HDAC3卻能激活一半以上的雄激素受體的下游基因，包括TMPRSS2[1]。

前列腺癌進展也一直與組蛋白調節酶的過度表達相關，其中的許多種是前列腺癌獨立的預后指標。賴氨酸特異性脫甲基酶1A(lysine-specific demethylase 1A,KDM1A)是第一個被發現的組蛋白賴氨酸脫甲基酶。KDM1A與雄激素受體相互作用，通過轉錄組蛋白H3 lys9m1和H3 lys9m2促進激素依賴的其下游目標基因的轉錄。在前列腺癌中，高水平的KDM1A與患者的復發風險的增加呈正相關。KDM4C被確定為第一個調節雄激素受體功能的組蛋白賴氨酸脫甲基酶。KDM4C與KDM1A在前列腺中能通過H3 lys9m的脫甲基，從而協同刺激雄激素受體依賴的基因轉錄[1-2,6]。

多梳組蛋白能長期維持發育調節基因的轉錄沉默，這個小組的成員之一組蛋白賴氨酸脫甲基酶果蠅zeste 基因增強子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)，是參與細胞記憶、X染色體失活、胚系發展和干細胞多能性的一種轉錄抑制因子。EZH2通過H1lys26、H3lys9和H3lys27影響其下游基因的甲基化[7-8]。EZH2在前列腺癌中表達，并和其轉移密切相關；EZH2的水平在去勢抵抗性前列腺癌患者中也升高[9]。

1.4前列腺癌中的非編碼RNA改變 非編碼RNA這些分子被認為間接參與了通過轉錄后關鍵表觀酶的失活，長鏈的非編碼RNA形成了組蛋白變化的骨架，非編碼RNA中的小分子RNA已成為前列腺癌細胞中DNA甲基化的一個靶點[6,10-11]。與之相關的一些畸變促進基因組不穩定性，并導致腫瘤抑制基因沉默和致癌反轉錄病毒激活[6,10-11]。非編碼RNA在前列腺癌中的作用是很關鍵的，如其中的HoX反義基因間RNA可作為支架，使綁定特定的酶復合物(PRC2和KDM1A)到它們的目標基因。另外，miR-101能直接參與EZH2的表達，在大約1/3的前列腺癌中miR-101的表達缺失，導致EZH2表達的增加[12]。

由此可見，在前列腺癌中存在多種形式的非常重要的表觀遺傳學改變，因此針對前列腺癌的治療也包括針對這些表觀遺傳學改變的治療。

2 表觀遺傳學的相關基因和針對的靶向治療

2.1組蛋白去乙酰化酶抑制劑 組蛋白去乙酰化酶抑制劑可以選擇性地誘導腫瘤細胞凋亡，而不會產生嚴重的不利影響。組蛋白去乙酰化酶抑制劑有很多種，根據其化學結構和療效的不同可分為7類：短鏈脂肪酸、氧肟酸化合物、環四肽、苯甲酰胺類、三氟甲基酮、氧肟酸苯衍生物栓和其他化合物[13-18]。這些HDAC抑制劑誘導前列腺癌細胞凋亡的作用不同，每種抑制劑針對不同的細胞系起作用：① 短鏈脂肪酸的HDAC抑制劑類，包括酸丁酸和丙戊酸，其中酸丁酸在體外需要毫摩爾的量才能達到抑制效果，這可能限制其在臨床的應用；丙戊酸抑制前列腺癌生長的作用在裸鼠身上經過驗證，本劑具有包括多種效果，阻滯細胞周期，增加細胞凋亡，減少腫瘤血管生成和誘導腫瘤細胞衰老的作用[13-18]。②異羥肟酸化合物，包括曲古菌素A(從吸水鏈霉菌中分離得到)以及人工合成化合物伏立諾他和帕比司他，這類化合物較短鏈脂肪酸劑的療效更好：通過結合酶的催化部位，僅需要微摩爾或者納摩爾的量即可在體內外起作用；曲古抑菌素A和伏立諾他通過抑制前列腺癌細胞的生長，都引起細胞死亡，抑制雄激素受體(androgen receptor,AR)的表達；伏立諾他還能抑制CWR22細胞系的動物模型中前列腺癌的生長[13-18]。③高度有效的HDAC抑制劑環四肽類包括羅咪酯肽、Trapoxin A和組蛋白脫乙酰酶抑制劑Apicidin。其中羅咪酯肽能誘導NIH 3T3細胞形態轉化逆轉，僅需要納摩爾的量就能抑制在G1和G2/M期細胞周期的過渡，也能抑制動物實體腫瘤的生長[13-18]。④還有多樣化的合成劑，如恩替諾特和Tacedinaline，在微摩爾的量時起效：恩替諾特捕獲人前列腺癌細胞(PC-3)和LNCaP，誘導細胞DU145細胞死亡，抑制體內的這三種腫瘤細胞株皮下移植瘤的生長，其中前列腺癌轉基因小鼠(transgenic adenocarcinoma of the mouse prostate，TRAMP)模型幫助證實了其對前列腺癌的治療作用[1,13]。⑤羥-栓通過B細胞淋巴瘤和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶導致細胞凋亡，并對PC-3鼠模型起作用[1,13-18]。⑥最后兩類HDAC抑制劑類包括電酮、三氟甲基酮和雜化合物Depudecin和Mocetinostat，目前還沒有公布相關的證據[1]。

2.2HDAC抑制劑的作用方式 幾乎所有的HDAC抑制劑導致在G1～S交界處的細胞分化和細胞周期阻滯，并且HDAC抑制劑通過調節宿主免疫反應和腫瘤血管的形成，影響腫瘤的生長[13-18]。而某些類別的HDAC抑制劑通過改變直接參與血管生成的表達基因，如血管內皮生長因子和乏氧誘導因子1a起到抑制作用。血管生成抑制劑可以限制原發腫瘤的養分供應，也能抑制阻止腫瘤細胞進入血液循環轉移擴散；HDAC抑制劑可通過上調增加的主要組織相容性復合類和二類蛋白表達的腫瘤細胞的免疫原性，并共同刺激或黏附分子；這些變化使癌細胞更容易受到免疫系統的破壞，也可以通過調節改變增強免疫細胞活性的細胞因子產生抗腫瘤免疫[1,13-18]。

然而，HDAC抑制劑伏立諾他和帕比司他也阻止了AR基因轉錄抑制雄激素受體介導的轉錄激活，通過與RNA聚合酶Ⅱ的復雜的裝配干涉雄激素受體在靶基因啟動子的表達[13-18]。

2.3核苷DMT抑制劑 在DNA合成中，經過藥物治療后，甲基轉移酶活性缺乏會導致納入基因組甲基化的胞嘧啶減少。應用于動物實驗和臨床試驗的藥物有：5-氮胞苷、地西他濱、二氫-5-胞苷、法扎拉濱和Zebularine，其中前兩個最好，都被廣泛應用于細胞培養模型，通過對抗DNA的甲基化和恢復沉默的基因表達起作用；在臨床研究中經證實，這兩種藥物在治療血液系統惡性腫瘤有巨大的潛力，并且5-氮胞苷已經獲得美國食品藥品管理局的批準用于骨髓增生異常綜合征的治療，對于前列腺癌也有巨大的潛力[1,19]。

但是，這5種藥物對于實體腫瘤的治療有其局限性：5-氮胞苷和地西他濱有很強的細胞毒作用，還有致突變和腫瘤的不良反應等，并且它們高度不穩定，以及由于能被水解裂解和脫氨胞嘧啶脫氨酶降解導致半衰期短；Zebularine在水溶液中穩定，在動物實驗中毒性最小的抑制胞苷的脫氨酶。因此，幾種藥物聯合應用可能效果較好[1,19]。

2.4非核苷類抑制劑 由于核苷轉移酶抑制劑有較大的毒性反應，無需事先摻入到DNA而直接作用于這些酶的化合物治療成為了重點[1]：如局部麻醉劑普魯卡因和普魯卡因胺及其衍生物。已被證明，在LNCaP的體內外模型中，普魯卡因胺抑制GSTP1甲基化和恢復GSTP1的表達[1]。普魯卡因胺被認為是直接抑制DNMT1結合的DNA豐富的CpG序列，抑制酶和CpG的結合[1]。其他方法包括利用反義RNA或小分子干擾核糖核酸降解DMT的信使RNA：RG108，一種人工合成設計的分子，直接抑制DMT，從而有效地在體外阻止這些酶并無毒性作用[1]。所有上述與前列腺癌患者的新型藥劑的作用仍有待探索。然而，一些研究表明，非核苷轉移酶抑制劑不見得比核苷DMT抑制劑類藥物毒性作用小；此外，非核苷類藥物的療效也比較差[1]。

3 化學預防

越來越多的證據表明，腫瘤在發展成侵襲性以前會有一些表觀遺傳學異常；在前列腺癌的早期階段幾乎是普遍的GSTP1滅活，這意味著抑制GSTP1的甲基化可能是一種防止惡化成前列腺癌的有效方法[1,20-21]。此外，由于許多不同基因啟動子的甲基化發生在前列腺癌的早期階段，表觀基因可能是一個潛在的化學預防目標[1]。啟動子甲基化是最早的分子異常之一，在整個疾病進展中持續存在，并且廣泛低甲基化在疾病轉移時更加明顯[1,20-21]。啟動子超甲基化和原癌基因激活是一個尚待探索的現象，對此發生的時間和程度尚不清楚[1,20-21]。

4 膳食成分的影響

天然存在膳食中的一些有治療作用的成分：綠茶中的沒食子兒茶素-3-沒食子酸、重多酚；大豆中的染料木素、大豆主異黃酮；異硫氰酸酯，如十字花科蔬菜中的苯乙酯異硫氰酸酯[1]。在前列腺癌細胞系中，微摩爾量的這些化合物就能抑制DMT和HDAC的活性，復蘇抑癌基因的活性等治療作用[1]。苯乙基異硫氰酸酯誘導通過蛋白激酶B和核因子κΒ信號通路抑制前列腺癌細胞株及移植瘤的生長。姜黃素有許多藥用價值和抗癌特性，此化合物會導致p53產生和組蛋白H3和H4一樣的磷酸化和乙酰化：姜黃素與異硫氰酸苯乙酯結合，可大大降低PC-3小鼠移植瘤的生長，已經有報道證明有此種飲食習慣的人們發病率低，雖然這些飲食中的成分所起作用的大小還不明確，但長期堅持此類飲食確實有保護作用，這為以后的相關藥物開發提供了新的方向[1]。

5 綜合治療

由于組蛋白去乙酰化酶抑制劑療效好，毒性反應最少，可以聯合他和其他類藥物：如對于DU145、胞苷和曲古菌素A聯合治療優于單獨治療；還有應用HDAC抑制劑羅咪酯肽、伏立諾他、丁酸鈉和曲古菌素A中的任意一種，聯合腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體，對于前列腺癌細胞系，可以增強對腫瘤的細胞毒作用，并協同增加其凋亡；另有文獻報道，組蛋白去乙酰化酶抑制劑聯合傳統的化療藥物(多西他賽)或雄激素抑制劑(比卡魯胺)，對于前列腺癌細胞也有較好的抑制作用[22-24]。

DNMT聯合化療藥物或雄激素抑制劑：應用地西他濱和紫杉醇或順鉑聯合治療有協同作用，對前列腺癌細胞生長的促進凋亡誘導和細胞周期停滯，在G2/M期過渡階段期的抑制作用；而對TRAMP鼠，聯合地西他濱和去勢治療優于單一治療[22-24]。

6 問題與展望

目前，表觀遺傳學作為研究的熱點，越來越受到廣泛的關注，針對其進行的藥物治療也在不斷地探索和完善。雖然目前已經有了很多成熟的藥物在臨床應用，但是它們的作用機制需要進一步探討研究，并且一些甲基化改變在治療后仍能持續存在從而影響療效。一些藥物，如地西他賓和氮胞苷的不良反應和毒性也限制了其在臨床的應用；而一些毒性作用小的非核苷轉移酶抑制劑的藥物，療效則非常有限，難以在臨床應用[1，25]。

目前對前列腺癌的治療，表觀遺傳學上有了一些進展[1，25]。由于前列腺癌的進展相對緩慢，疾病周期較為漫長。行前列腺癌根治術后，前列腺特異抗原和腫瘤生長等得到了較好的控制，疾病預后的生存時間長，為不同的治療提供了機會和觀察的時間[1-2，25]。當前，針對雄激素受體信號系統的新藥開發和聯合治療有很大潛力，而在表觀遺傳學上的探索對其的治療也開辟了嶄新的方向[1，25]。相信隨著研究的深入，相關的藥物會有更加廣闊的應用前景。

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