無創DNA產前檢測在篩查胎兒非整倍體染色體病的應用

郭偉誠 林惠玲

1 澳門塔石衛生中心； 2 澳門黑沙環衛生中心

近年來，隨著社會模式和觀念的改變，女性在社會上擁有事業的發展和經濟獨立的能力，因此，女性婚育年齡有上升的趨勢，婦女生育年齡的上升除增加妊娠并發癥的風險外，也提高了出生缺陷的風險，以21－三體綜合征為例，懷有染色體異常胎兒的風險隨孕婦年齡的增長而提高，數據顯示，在20～24歲之間，患病率為1／1 400，～35歲為1／350，～40歲為1／100，～45歲或以上為1／25［1］。傳統結合血清學和超聲影像學檢查的無創聯合篩查雖然敏感性高但假陽性也較高，不少篩查陽性孕婦實際上進行了不必要的有創性診斷檢查，因而為孕婦帶來心理負擔和操作相關的流產風險。因此，臨床上需要一種無創而可靠的產前檢查方法。本文將以新近研究和應用的無創DNA產前檢測方法進行綜述。

1 非整倍體染色體病的簡介

染色體病（Chromosomal disease）是指由于先天性的染色體數目異常或結構畸變而引起的疾病。染色體異常是導致出生缺陷的重要原因。數據顯示，約160例新生兒中就有1例是染色體異常患者［2］。在眾多染色體異常中，以非整倍體染色體病所導致的殘障及生活障礙尤為顯著。非整倍體（aneuploid）是指其染色體的數目并非單倍體（haploid）的整倍數，而是在數目上出現多于或少于整倍體，如45或47條染色體。常見的非整倍體患者是某對染色體不是2條而是出現3條，稱為三體綜合征（Trisomic syndrome）。如果某對染色體缺少1條，則稱為單體綜合征（Monosomic syndrome）。染色體異常常表現為具有多種畸形的綜合征，這些綜合征表現為多發性畸形、智力低下和生長發育遲緩，此外，還可表現為一些特征性的皮膚紋理改變。染色體畸變可導致死胎或流產，在自然流產胎兒中有20%～50%是由染色體異常所致。

目前已發現的人類染色體數目異常和結構畸變有10 000多種，已確定或已描述過的綜合征有100多種。染色體病一般分為常染色體病和性染色體病兩大類。常染色體病是指涉及第1～22號常染色體異常引起的染色體病。數據顯示，常染色體病的發生率可高達1／160例新生兒［2］。21－三體綜合征（Down綜合征，T21）、18－三體綜合征（Ewards綜合征，T18）和13－三體綜合征（Patau綜合征，T13）是三個最常見的常染色體非整倍體染色體疾病。其中以21－三體綜合征最為常見，發病率為1／800［2］。性染色體病是指涉及X、Y性染色體異常引起的染色體病。數據顯示，性染色體病的發生率為1／500例新生男嬰和1／850例新生女嬰［3］。Turner綜合征（45，X）和Klinefelter綜合征（47，XXY）是臨床上比較常見的性染色體病。

2 產前診斷非整倍體染色體病的現狀

對于非整倍體染色體病，目前仍缺乏有效的治療方法，因此，利用產前篩查找出患病胎兒并采取選擇性流產以達到降低出生缺陷發生率的方法已成為預防的重要手段，對于選擇繼續懷孕的夫婦，提早診斷可讓家長為患兒出生后的照顧和將來的培育作出提前的計劃和準備。目前產前診斷方法分為無創性和有創性兩大類。無創性檢查包括血清學、超聲診斷學檢查以及兩者聯合篩查。孕中期通過孕婦血清標志物甲胎蛋白（AFP）、游離雌三醇（μE3）及人絨毛膜促性腺激素（β－HCG）進行三聯血清學篩查是目前國內比較廣泛應用于臨床的產前篩查模式，由于是通過孕婦血清標志物水平間接反應胎兒的情況，因此存在敏感性（70%）不足和一定的假陽性率（5%）［4］。孕早期利用超聲波進行胎兒頸后透明帶檢查結合包括人絨毛膜促性腺激素（β－HCG）和妊娠相關血漿蛋白A（PAPP－A）的血清學檢查進行聯合篩查雖然可提高篩查的敏感性（90%）［5］，但頸后透明帶掃描的準確度受多種因素影響，包括操作者的技術水平和所使用的掃描儀器的精確度。有創性檢查包括絨毛、羊水和臍血細胞培養和核型分析檢查，是目前產前診斷非整倍體染色體疾病的金標準，但有創性檢查存在一定的流產風險（≤1%）［6，7］，在實際操作中給孕婦及其家屬帶來極大的心理負擔。雖然，通過篩查約有3%～5%孕婦被視為高危并需要進行有創性檢測，但實際上染色體異常的發病率遠低于此值，因此，不少孕婦進行了不必要的有創檢查。如何降低假陽性率和提高準確率以減少不必要的有創檢查一直是研究者們努力的方向。隨著分子遺傳學的快速發展，無創性產前診斷越來越受到臨床的重視和研究。

3 無創DNA產前檢測的基本原理

無創DNA檢測技術最早起源于母體外周血中胎兒游離DNA（cell free fetal DNA，cffDNA）片段的發現。1997年香港中文大學的盧煜明教授等發現母體外周血中存在Y染色體片段，經過進一步PCR擴增技術獲得Y染色體的特異性DNA序列，因而確認懷有男性胎兒的母體血中存在胎兒cffDNA［4］。無創產前基因檢測技術開拓了篩查胎兒非整倍體染色體病新的發展方向。胎兒染色體異常會帶來母體中DNA含量的微量變化，通過深度測序及生物信息可分析檢測到該變化，為項目提供理論依據。cffDNA主要來源于胎盤滋養層細胞，它自妊娠7周左右胎兒胎盤循環建立后即以一定比例存在于母體外周血循環中，母體血循環中約10%～15%的cffDNA來自胎兒［8］，其含量隨妊娠周數的增大而增多，而在分娩后2h即完全降解［4］，因此，它可以反映是次妊娠的胎兒情況。以21－三體綜合征為例，懷有患病胎兒的母體血中存在超量的21號染色體片段，但這種變化非常微小，需要利用靈敏的方法進行檢測。隨著分子生物學技術的成熟，目前，無創DNA產前檢測（Noninvasive prenatal testing，NIPT）是利用大規模平行測序技術（Massively parallel sequencing，MPS）對母體外周血中的cffDNA（包含胎兒cffDNA）進行深度測序，利用生物統計學方法將測序結果進行生物信息分析，可以從中獲得胎兒的遺傳信息，并根據分析結果評估胎兒患非整倍體染色體病的風險。

4 無創DNA產前檢測的技術現狀

21－三體綜合征、18－三體綜合征和13－三體綜合征T21、T18和T13是三個比較常見的非整倍體染色體病，其發病率分別為1／800、1／6 000和1／10 000，因此，無創DNA產前檢測目前主要集中在該三項非整倍體病的檢測研究。目前還沒有足夠的研究資料說明它在診斷其他染色體病的應用價值。自2011年起，各國陸續發表了他們在無創DNA產前檢測非整倍體染色體病的研究結果，整合分析示T21、T18和T13的無創DNA產前檢測準確率分別高達到99.4%、97.4%和92.5%，而假陽性率則分別低至0.2%、0.5%和0.8%［9］。盡管無創DNA檢測具有準確率高和假陽性率低的特點，但它并非確診性檢查，陽性檢測結果仍需進行有創性檢查進一步確診。然而，陰性結果可減少高危孕婦進行不必要的有創檢查。

理論上說，胎兒cffDNA的檢測還可以應用于性染色體和其他非整倍體染色體病的檢測，但對于其他罕見的染色體數目異常、嵌合體、易位型和微缺失微重復的相關研究報道仍較少，因此針對少見染色體病的檢測仍需要進一步研究分析。研究指出，該檢測對胎兒性別鑒定的準確率達到99%以上［10］，但由于非醫學目的的胎兒性別鑒定并非常規檢測項目，而且抵觸于我國法律，因此，該技術仍未在我國進行臨床應用。由于目前有關無創DNA檢測的主要研究對象為自然受孕婦女，對于輔助生殖下懷孕的婦女，目前該技術的應用仍需要進一步的研究證據。

5 無創DNA產前檢測的特點和適應證

對于孕婦來說，無創DNA檢測是一項簡單的血清學檢查，只需要抽取5ml的母體靜脈血而無須空腹進行。該操作可避免于有創檢查所帶來的胎兒宮內感染和流產的風險。由于目前有關無創DNA產前檢測的研究主要集中于高危單胎妊娠婦女，因此，對于風險較低和多胎妊娠婦女，它的應用價值仍欠缺相關的研究數據支持。作為產前篩查，無創DNA檢測應在充分的產前咨詢和風險評估后的一項選擇性檢查。一般建議最佳檢測時間為妊娠12～24周，而且應在孕早期超聲檢查確定妊娠周數和排除多胎妊娠后進行。它不能取代孕早、中期的超聲波檢查和血清學檢查在篩查開放性神經管畸形和胎兒結構性異常等方面的應用。無創DNA產前檢測主要適用于以下情況：（1）孕婦在預產期年齡≥35歲；（2）胎兒超聲檢查結果顯示非整倍體的風險增加；（3）既往妊娠中曾懷有三體綜合征胎兒；（4）產前篩查包括孕早期超聲檢查、血清學檢查或聯合篩查結果顯示為高危者；（5）親代為13、21號染色體的平衡易位攜帶者［11］。

6 無創DNA產前檢測的發展現狀

無創DNA產前檢測還未成為我國有關醫療部門公認的標準。雖然，大多數醫院都未能普及進行該項檢測，目前能夠提供該技術的醫院主要分布在一、二線城市的三甲醫院，但有陸續開展該檢測項目和逐漸普及的趨勢。將來該技術還可能應用于胎兒染色體微缺失微重復、單基因病甚至全基因組的無創基因檢測［9］。

7 總結

產前篩查其中一個主要目的是提早發現非整倍體胎兒，傳統無創性血清學和超聲影像學檢查存在敏感性不足和假陽性率高的問題。近年來，母體外周血中胎兒游離DNA片段的發現為無創產前基因檢測開展了新的方向。無創DNA產前檢測是一項主要應用于21－三體綜合征、18－三體綜合征和13－三體綜合征的新檢測技術。它具有準確率高和假陽性率低的特點。它主要適用于預產期年齡≥35歲的高危單胎妊娠和其他產前篩查結果提示為高危的孕婦。它不能取代孕早、中期的超聲影像學和血清學篩查的應用，并應在充分的產前咨詢和風險評估后作為選擇性的檢測。由于它并非確診性檢查，陽性檢測結果仍需進一步進行有創性檢查確診。目前該檢測雖然未被普及應用，但隨著檢測技術的提高和檢測成本的降低，相信具有很大的發展潛力。

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