脂聯素基因單核苷酸多態rs266729、rs2241766、rs822396與老年缺血性腦血管病亞型相關性研究

相波，丁曉潔，王超，張磊，王曉青，潘旭東

脂聯素（adiponectin，ADIPOQ）是脂肪細胞分泌的激素蛋白，能增加胰島素敏感性及改善糖、脂代謝紊亂；參與炎癥反應，保護血管內皮、抑制血管內皮黏附；抑制單核巨噬細胞轉化為泡沫細胞；抑制血管平滑肌細胞增生與遷移；抑制細胞外基質降解，穩定粥樣斑塊，是一種保護性脂肪因子[1-4]。有臨床研究發現，ADIPOQ水平與缺血性卒中發病及其嚴重程度呈負相關[5-7]。動物實驗也表明ADIPOQ對于急性缺血性卒中具有腦保護作用[8-9]。

ADIPOQ基因編碼脂聯素，位于染色體3q27[10]，此區域被識別與2型糖尿病、代謝綜合征及心血管病變相關[10-11]，大量臨床研究已證實此區域能增加2型糖尿病、代謝綜合征及心血管病變的遺傳易感性[12-14]。糖尿病、肥胖、高血脂、高血壓病等是缺血性腦血管病的高危因素，而且心腦血管病有共同的病理生理基礎——動脈粥樣硬化，因此推測染色體3q27區域與增加缺血性卒中遺傳易感性也可能有相關性。目前關于此方面的研究較少，并且針對不同種族、不同地區的關聯性研究結果尚未得到有效的重復和肯定，因此我們選取位于此區域的ADIPOQ基因進行青島地區漢族人群缺血性腦血管病易感基因的病例對照研究；同時進一步研究缺血性腦血管病急性卒中治療低分子肝素試驗（Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment，TOAST）分型中的大動脈粥樣硬化性（large artery atherosclerosis，LAA）、小動脈閉塞性（small artery occlusion，SAO）患者中此基因是否有差異，初步探討基因多態性與缺血性腦血管病發病病因的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 病例組均為2011年1月～2013年6月于青島大學醫學院第一或第二附屬醫院神經內科住院且診斷為缺血性腦血管病的患者，年齡≥60歲。入組標準：診斷標準符合中華神經科學會第四屆全國腦血管病會議修訂的“各類腦血管疾病診斷要點（1995）”中缺血性腦血管病的診斷標準[15]。入選病例均經顱腦計算機斷層掃描（computed tomography，CT）和（或）磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）證實，并進行了經顱多普勒、顱腦血管超聲、顱腦磁共振血管成像（magnetic resonance angiography，MRA）及心臟超聲等檢查，臨床判斷符合TOAST分型中的LAA和SAO分型。排除標準：①嚴重感染、腦血管畸形/動脈瘤、除顱腦外其他部位血栓性疾病、腫瘤、血液病、自身免疫性疾病等原因導致的繼發性缺血性腦血管病；②心源性栓塞、其他病因或不明原因型缺血性腦血管病；③嚴重心、肝、腎功能不全。本研究按TOAST分型選取LAA組144例，SAO組221例，共365例患者，其中男性176例，女性189例。

選取同期查體中心年齡≥60歲的查體者為對照組，并且既往無缺血性腦血管病病史，顱腦CT或MRI證實無腦梗死灶者。共402例對照，其中男性209例，女性193例，其性別、年齡與缺血性腦血管病組相匹配。

1.2 臨床數據 應用調查問卷了解研究對象的姓名、性別、年齡等一般情況及吸煙病史（每天吸煙量＞10支）、飲酒史（飲白酒或有色酒＞100 g/d或啤酒每天＞1 L）[16]、既往史、家族史；入院后測量血壓、身高、體重，晨起抽取空腹血檢測生化指標。計算體重指數（body mass index，BMI），BMI=體重（kg）/身高2（m2）。研究符合我院所制訂的倫理學標準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.3 單核苷酸多態性的選擇及其基因多態性檢測從美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）數據庫中選取位點，微小等位基因頻率應在亞洲人群中＞0.05且其異型性已知；根據有無臨床資料，我們選擇3個SNPs即rs266729（-11377C/G）、rs2241766（-45T/G）、rs822396（-3964A/G）進行檢測。所有受試者均于清晨空腹抽取前臂靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，常溫下2700 rpm/min離心10 min，收集細胞層，凍存于－80℃冰箱待用。應用血液基因組快速抽提試劑盒（上海生工SK8224）提取脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）。rs266729（-11377C/G）、rs2241766（-45T/G）采用聚合酶鏈式反應連接的限制性片段長度多態性（polymerase chain reaction linked restriction fragment length polymorphism，PCRRFLP）鑒定基因多態性（PCR擴增引物和限制性內切酶見表1），分別鑒定出rs266729（-11377C/G）的3種基因型CC、CG、GG和rs2241766（-45T/G）的3種基因型TT、TG、GG。PCR總反應體系25 μl：DNA模板100 ng，5 U/μl Taq DNA擴增酶（上海生工SK2492）0.25 μl，10×PCR緩沖液2.5 μl，2 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）Mix 2 μl，25 mmol/L MgCl22.5 μl，上、下游引物各2.5 μl（2 μmol/μl，上海生工合成），加雙蒸水至25 μl。PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個循環，72℃延伸10 min。PCR反應結束后，取5 μl PCR產物經瓊脂糖電泳鑒定，剩余20 μl PCR產物分別用限制性內切酶HhaI酶（Thermo scienti fi c ER1851）和SmaI酶（Thermo scienti fi c ER0661）過夜消化后，電泳觀察分析。rs822396（-3964A/G）位點未找到天然內切酶，采用直接測序法分析（上海生工完成），鑒定出AA、AG及GG3種基因型。

1.4 數據分析 采用SPSS 17.0統計軟件分析數據，計數資料以率表示，比較采用χ2檢驗；計量資料符合正態分布，平均數以表示，3組計量資料比較采用單因素方差分析，P＜0.05差異有顯著性。用Hardy-Weinberg平衡檢驗確定樣本是否具有群體代表性。采用SESsis在線軟件（http：//analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php）進行基因分析，基因型和等位基因風險率采用比值比（odds ratio，OR）表示。

2 結果

2.1 LAA組、SAO組、對照組一般臨床資料比較 3組研究對象一般臨床資料相比較，年齡、性別、飲酒史、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病病史、BMI、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白水平無顯著差異（P＞0.05），但吸煙史、血壓、總膽固醇、空腹血糖水平有顯著差異（表2）。

2.2 基因型分布的比較 rs822396、rs266729和rs2241766 3個SNP的基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。

rs266729的基因型分布在LAA組、SAO組與對照組3組中有顯著差異（P=0.036）。在3組中進一步兩兩比較結果顯示：SAO組中rs266729（-11377C/G）GG基因型分布高于對照組（P=0.009）；而LAA組與SAO組比較及LAA組與對照組比較差異均無顯著性（P＞0.05）。

表1 鑒定rs266729（-11377C/G）和rs2241766（-45T/G）位點的PCR引物及限制性內切酶

rs822396、rs2241766的基因型分布在3組中無顯著差異（P＞0.05）（表3）。

2.3 SAO組和對照組中rs266729基因型分布在顯性（GG+GC/CC）、隱性（GG/GC+CC）、累加（GG/CC）這3種模式下，進一步研究rs266729基因型分布在SAO組和對照組中的差異。結果顯示，在隱性、累加模式下rs266729基因型分布差異有顯著性（P=0.004，P=0.003），在顯性模式下差異無顯著性。G等位基因能增加SAO型缺血性腦血管病的風險（表4）。

3 討論

ADIPOQ是保護性脂肪因子[1-4]。臨床研究發現ADIPOQ水平與缺血性卒中嚴重程度呈負相關[5-7]。動物實驗也表明ADIPOQ對于急性缺血性卒中具有腦保護作用[8-9]。

編碼ADIPOQ的基因位于染色體3q27區域，全長約17 kb，含3個外顯子和2個內含子。rs266729位于ADIPOQ基因啟動子區域。劉芳等[17]、陳小良等[18]研究認為rs266729 G等位基因與增加中國北方漢族人群缺血性腦血管病易感性有關。Patel等[19]研究發現在歐洲高加索健康人群中，相對于C基因，rs266729 G基因攜帶者頸動脈內膜厚度增加更明顯，而且這種相關性不受血漿ADIPOQ水平影響。本研究發現在SAO組中rs266729（-11377C/G）GG基因型分布顯著高于對照組，在隱性、累加模式下也得到同樣的結果，提示rs266729與缺血性腦血管病相關，其G等位基因變異可增加SAO型缺血性腦血管病的風險。與此相反，Hegener等[20]發現rs266729 G等位基因變異與降低美國人群缺血性腦血管病發病的危險性相關。不同研究結果不同，不排除rs266729 G等位基因變異具有種族差異性可能。

表2 LAA組、SAO組、對照組一般臨床資料分析

表3 ADIPOQ基因3個SNP基因型分布

表4 SAO組和對照組中rs266729基因型分布

有學者[21]在大鼠脂肪細胞中發現G等位基因能改變ADIPOQ基因DNA結合活性降低啟動子的活性，啟動子的活性降低使ADIPOQ基因表達減少而出現低血漿ADIPOQ水平。同樣，Zhang等[22]在遺傳性糖尿病腎病患者中發現G基因能改變轉錄因子SP1在啟動子區域的結合位點，從而導致啟動子功能降低。G基因與低水平的ADIPOQ相關是其增加缺血性腦血管病易感性的因素，研究報道C等位基因更多與低水平胰島素抵抗相關[23]，但是C基因與疾病的相關性機制目前還不清楚。

臨床常用的TOAST分型側重于缺血性腦血管病的病因。有研究發現缺血性腦血管病的類型與血漿ADIPOQ水平也有相關性[24]，顱內動脈粥樣硬化組水平最低，顱外動脈粥樣硬化組水平次之，心源性卒中組水平最高。相對于年青患者血管畸形、動脈炎等致病因素，我們選取與老年患者病因密切相關的LAA型及SAO型缺血性腦血管病進行研究分析。

SAO型缺血性腦血管病主要累及小血管，病因多與高血壓有關，病理類型有小動脈硬化、纖維素樣壞死及玻璃樣變等。Ong等[25]研究發現rs266729 G等位基因與高血壓病相關，Machado等研究發現[26]與妊高征和先兆子癇有關；因此，rs266729 G等位基因變異可增加與高血壓病密切相關的SAO型缺血性腦血管病發生率。LAA型的病因為顱內外大血管動脈粥樣硬化，發病機制包括載體動脈（斑塊或血栓）堵塞穿支、動脈-動脈栓塞、低灌注/栓子清除率下降等。Yamada等[27]發現rs266729 GG基因型能增加日本人群中代謝綜合征患者動脈粥樣硬化性腦梗死的風險。本研究發現rs266729 G等位基因變異與LAA型缺血性腦血管病無相關性，我們考慮原因可能是ADIPOQ基因不僅與動脈粥樣硬化有關[19]，而且與高血脂、糖尿病、高血壓病等腦血管病危險因素相關，各種致病因素縱橫交錯共同作用、相互影響，不能用單一因素考慮。例如中國臺灣學者Chang 等[28]的研究證實傳統的發病高危因素血壓水平、膽固醇水平影響ADIPOQ基因多態性和冠狀動脈血管病變發病風險的相關性。該研究發現ADIPOQ基因rs2241766（+45T＞G）G等位基因是冠狀動脈血管病變的低度風險因素（OR 0.76；95%CI 0.64～0.89；P=0.001），但是在血壓≥140/90 mmHg、血清膽固醇水平≥200 mg/dl時，rs2241766 G等位基因對于冠狀動脈血管病變的保護作用消失。另外，遺傳和環境因素相互影響共同作用，基因型與臨床癥狀（表型）之間及二者與致病性之間仍存在復雜的機制需要進一步研究。

rs822396位于ADIPOQ基因第二個內含子區域，My-Young Cheong等[29]研究顯示rs822391、rs822396與缺血性腦血管病相關，Hegener等[20]研究發現包含rs822396在內的單倍型（GAG）與降低缺血性腦血管病相關。rs2241766位于ADIPOQ基因第二個外顯子區域，陳小良等[18]研究認為rs2241766基因多態性與中國北方漢族總體人群缺血性腦血管病的易感性相關。本研究發現rs822396、rs2241766與LAA型/SAO型缺血性腦血管病均無相關性，支持劉芳等[17]及Hegener等[20]研究結果。

研究人群的遺傳背景、研究對象的入選標準及實驗設計、樣本大小均會導致研究結果不一致，提示ADIPOQ基因有種族、地域差異。Yuan Yang等[30]針對12 465例病例進行Meta分析也證實ADIPOQ基因能增加亞洲人群冠狀動脈血管病變的發病風險而降低高加索人群的發病風險；不同的SNP與冠狀動脈血管病變有不同的相關性。目前尚無關于ADIPOQ基因多態性與缺血性腦血管病易感性的Meta分析，并且，僅在美國[20]、歐洲[19]、亞洲[17-18，27]人群中進行的幾項研究結果顯示結論明顯不一致，因此應在不同種族、不同區域的人群中進行進一步的關聯性研究。本研究尚有局限性，例如樣本數量偏少，未選取連鎖不平衡區域內（啟動子或第二個外顯子、內含子交界處）的SNP位點進行單倍型分析。下一步我們希望重點選取連鎖不平衡區域的SNP位點及擴大樣本進行研究，同時初步從基因表達后轉錄水平方面探討基因變異對缺血性腦血管病發病易感性的影響及其分子機制。

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【點睛】

本研究分析了老年大動脈粥樣硬化性、小動脈閉塞性缺血性腦血管病以及健康對照人群的脂聯素基因多態性，顯示該研究人群中，rs266729（-11377C/G）G等位基因變異可增加小動脈閉塞性缺血性腦血管病的風險。