醛糖還原酶基因5′端（AC）n多態(tài)性與糖尿病腎病、糖尿病周圍神經(jīng)病變的相關(guān)性*

雷佩佩劉長山王秀軍薛亞梅

醛糖還原酶基因5′端（AC）n多態(tài)性與糖尿病腎病、糖尿病周圍神經(jīng)病變的相關(guān)性*

雷佩佩①劉長山②王秀軍②薛亞梅①

目的：探討2型糖尿病（DM）醛糖還原酶（AR）基因5′端的（AC）n的多態(tài)性與糖尿病腎病（DN）、糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）易感性的關(guān)系。方法：選擇本院2型DM患者119例為DM組，根據(jù)其同時伴（+）或不伴（-）DN與DPN，將DM組分為四個亞組：DN-/DPN-組、DN-/DPN+組、DN+/DPN-組、DN+/DPN+組；同時選取健康體檢者62例為正常對照（CON）組。采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及尿素/甲酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染顯色法分析各組AR基因的二核苷酸（AC）n串聯(lián)重復(fù)序列的多態(tài)標(biāo)記，比較各組間等位基因頻率和基因型頻率。結(jié)果：各組中Z-2等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中在DN+/DPN+組最高，在DN-/DPN-組最低；Z+2等位基因頻率在DN-/DPN-組顯著增高，在DN+/DPN+組顯著降低，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；純合子Z-2/Z-2基因型頻率在DN+/DPN+組顯著高于其余各組，而純合子Z+2/Z+2基因型頻率在DN-/DPN-組顯著高于其余各組。結(jié)論：Z+2等位基因是2型糖尿病患者發(fā)生DN及DPN的保護(hù)性基因；Z-2等位基因是DN易感基因，而病程和Z-2等位基因可能共同促進(jìn)了DPN的發(fā)生。

2型糖尿病； 醛糖還原酶； 糖尿病腎病； 糖尿病性周圍神經(jīng)病變

糖尿病腎病（DN）及糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）均為較常見的糖尿病微血管并發(fā)癥（DMAP），嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。目前大量證據(jù)表明遺傳因素與環(huán)境因素同樣在DMAP的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，醛糖還原酶（AR）基因則是目前最受重視的候選基因之一。本研究旨在探討山東地區(qū)2 型DM患者AR基因5′端的（AC）n的多態(tài)性與DN、DPN易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 按照1999年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)選擇本院2012 年3月-2013年8月住院或門診2型糖尿病患者119例為2型糖尿病（DM）組。根據(jù)其同時伴（+）或不伴（-）DN與DPN，將DM組分為四個亞組：DN-/DPN-組、DN-/DPN+組、DN+/DPN-組、DN+/DPN+組。其中DN診斷標(biāo)準(zhǔn)為6個月內(nèi)連續(xù)3次測定UAER≥20 μg/min，并排除其他疾病所致的尿白蛋白異常和腎功能不全；DPN診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）肢體感覺及運(yùn)動神經(jīng)障礙癥狀：如患肢麻木、針刺或灼熱樣疼痛、蟻行感或踏棉墊感等；（2）深淺感覺明顯減退，跟腱反射減退或消失；（3）肌電圖檢查提示運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度（MNCV）、感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度（SNCV）減慢；（4）排除其他原因所致周圍神經(jīng)病變。以上患者排除糖尿病急性并發(fā)癥及甲狀腺、垂體疾病等其他內(nèi)分泌疾病。同時選取健康體檢者62例為正常對照（CON）組，全部研究對象均來自山東地區(qū)人群，彼此間無血緣關(guān)系。考慮到隨年齡增加致機(jī)體老化對周圍神經(jīng)病變的影響，本次研究排除年齡＞65歲的患者，入選的DM患者病程均＞7年。DM各組空腹血糖（FBG）及糖化血紅蛋白（HbA1C）均高于CON組；DM各亞組中，DN-/DPN+組及DN+/DPN+組病程均顯著高于其余各亞組，其余指標(biāo)在各組間差異不明顯，見表1。

表1 各組一般臨床資料

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 取凍存抗凝全血0.5 mL，用solarbio全血基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取DNA，-20 ℃保存。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 引物序列參考文獻(xiàn)[1]設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程公司合成。上游引物：Pr1 5′-GAATCTTAACATGCTCTGAACC-3′， 下 游 引 物：Pr2 5′-GCCCAGCCCTATACCTAGT-3′。PCR反應(yīng)體系共25 μL：10×Buffer2.5 μL，dNTP、TagDNA聚合酶各0.25 μL，Pr1、Pr2各1.0 μL，模板DNA2.0 μL，滅菌三蒸水18 μL。參數(shù)如下：94 ℃預(yù)變性5min多30 s，94 ℃變性1min多30 s，56.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共33個循環(huán)，末次循環(huán)后于72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取10 μL的PCR產(chǎn)物與2 μL加樣緩沖液混勻后，于120 g/L聚丙烯酰胺凝膠上電泳（100 mV，15 h），保持低溫。凝膠用硝酸銀染色法顯示結(jié)果。

1.2.3 DNA測序 選取部分基因型為純合子的PCR產(chǎn)物送上海生物工程公司進(jìn)行測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)、方差分析或Q檢驗(yàn)，并確認(rèn)符合Hardy-weinberg平衡，計(jì)數(shù)資料比較采用 χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5′端（AC）n雙核苷酸多態(tài)性檢測結(jié)果 CON組及DM各組均檢測到7種等位基因，將最常見的（AC）24命名為Z，并將（AC）n的重復(fù)數(shù)n為21、22、23、25、26、27依次命名為Z-6、Z-4、Z-2、Z+2、Z+4、Z+6。PCR產(chǎn)物長度132～144 bp。

表2 各組等位基因頻率比較 次（%）

2.2 AR等位基因頻率的比較 各組中Z-2等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中在DN+/DPN+組最高，DN+/DPN-組次之，在DN-/DPN-組最低；Z+2等位基因頻率在DN-/DPN-組顯著增高，在DN+/DPN+組顯著降低，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 各組含Z+2等位基因基因型頻率分布 Z+2/Z+2基因型頻率在DN-/DPN-組顯著增高；X/X基因型頻率在DN+/ DPN+組顯著增高。各組分別含Z+2、Z-2等位基因的基因型頻率分布情況見表3。

2.4 各組含Z-2等位基因基因型頻率分布 Z-2/Z-2等位基因頻率在DN+/DPN+組顯著高于其余各組；Y/Y等位基因頻率在DN-/DPN-組最高，在DN+/DPN+組最低，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表3 各組含Z+2等位基因基因型頻率分布比較 次（%）

表4 各組含Z-2等位基因基因型頻率分布比較 次（%）

3 討論

臨床研究表明DMAP的發(fā)生不總與血糖水平有關(guān)，高糖血癥不是DMAP唯一因素。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，糖代謝的多元醇通路與DMAP有密切關(guān)系。AR是多元醇通路的限速酶，廣泛存在于神經(jīng)、視網(wǎng)膜、晶體、腎小球和血管壁等非胰島素依賴性組織。在生理的血漿葡萄糖濃度下，AR對葡萄糖的親和力低（Km=70 mmol/L），所以該通路代謝率極低。當(dāng)某些因素導(dǎo)致AR激活，它對葡萄糖的親和力明顯上升（其Km值減小近10倍），對葡萄糖的轉(zhuǎn)化能力亦增強(qiáng)，使山梨醇在細(xì)胞內(nèi)大量產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受損而干擾細(xì)胞的正常代謝[1-2]。

本研究結(jié)果顯示：CON組及DM各組AR5′端（AC）n均存在7種等位基因（Z-6～Z+6）；Z+2等位基因頻率在DN-/DPN-組顯著增高，在DN+/DPN+組顯著降低，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且Z+2/Z+2基因型頻率在DN-/DPN-組顯著高于其余各組，提示Z+2等位基因是DN 及DPN的保護(hù)性基因；Z-2等位基因頻率在各組中有顯著差異（P＜0.05），其中在DN+/DPN+組最高，DN+/DPN-組次之，在DN-/DPN-組最低，同時Z-2/Z-2基因型頻率在DN+/DPN+組亦顯著高于其余各組，提示Z-2等位基因是DN的易感基因；因隨機(jī)選的DPN+患者病程顯著高于其他各組（P＜0.05），推測病程和Z-2等位基因可能共同促進(jìn)了DPN的發(fā)生。這與1997年Heesom等[3]的研究基本一致。Yang等[4]研究顯示，Z-2等位基因攜帶者AR基因轉(zhuǎn)錄活性最高，進(jìn)一步證明Z-2等位基因與DMAP有密切關(guān)系。但Park等[5]對韓國2型DM患者的研究中發(fā)現(xiàn)AR基因5′端多態(tài)性與DMAP易感性無關(guān)，Moczulski等[6]對高加索2型DM患者的研究發(fā)現(xiàn)，大量蛋白尿、微量蛋白尿及正常蛋白尿患者的Z-2和Z+2等位基因頻率并無明顯差異。國內(nèi)外各種研究結(jié)果不盡相同，可能與種族、樣本數(shù)及臨床情況等不同有關(guān)，還需要多種族大樣本的聯(lián)合研究。

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Relationship between the Polymorphism of（AC）n in 5′ End of the Aldose Reductase Gene and the Susceptibility of Diabetic Nephropathy， Diabetic Peripheral Neuropathy

LEI Pei-pei，LIU Chang-shan，WANG Xiu-jun，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（03）：018-020

Objective：To study the relationship between the polymorphism of （AC）n in 5′end of the AR gene and the susceptibility of diabetic nephropathy， diabetic peripheral neuropathy in type 2 DM.Method：Chosen our hospital 119 patients with type 2 DM for DM group， at the same time，according to its companion （+） or without （-） DN and DPN， DM group were divided into four subgroups： DN/DPN - group， the DN/DPN + group， DN + / DPN - group， the DN + / DPN + group； At the same time chosen 62 cases of healthy check-up as normal control group （CON）. The polymerase chain reaction （PCR） by urea， formamide and polyacrylamide gel electrophoresis， silver dye chromogenic method AR gene dinucleotide （AC） n polymorphism of tandem repeat sequence tags were used and analyze in each group， compared the allele frequency and genotype frequency of each group.Result：The frequence of Z-2 allele in DN+/DPN+ group was much higher than that in the other groups （P＜0.05）. The frequence of Z+2 allele in group DN+/DPN+ was much lower than that in the other groups （P＜0.01）； Z-2 / Z-2 genotype frequency in the DN+ / DPN+ group was significantly higher than that of the other groups， and Z+2 / Z+2 genotype frequency in the DN- / DPN- group was significantly higher than the other groups.Conclusion：AR gene alleles are associated with the development of diabetic microangiopathy. The Z+2 allele protect against the development and progression of DN and DPN. Whereas，the Z-2 allele may be a risk factor for the developing of DN. Both the course of DM and Z-2 allele promote the development of DNP.

Type 2 diabetes mellitus； Aldose reductase； Diabetic nephropathy； Diabetic peripheral neuropathy

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.03.007

2013-09-07） （本文編輯：蔡元元）

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（548945）

①濰坊醫(yī)學(xué)院 山東 濰坊 261042

②山東省濰坊市人民醫(yī)院

劉長山

First-author’s address：Weifang Medical School，Weifang 261042，China