卒中后抑郁細胞因子蛋白組學初探

耿磊鈺，唐浩，李文平，錢方媛，錢俊峰，李凌江，張志

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是卒中后常見并發癥之一。約有1/3卒中患者在卒中后不同階段罹患PSD[1]。PSD嚴重阻礙卒中后神經功能恢復，增加病死率、致殘率，降低患者生存質量，增加社會經濟負擔[2]。目前對PSD發病機制認識不一，有學者提出，細胞因子調節失衡是PSD的可能生物學病因[3]。已有研究顯示，白細胞介素6（interleukin 1，IL-6）、白細胞介素18（interleukin 18，IL-18）及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）等促炎因子水平在PSD患者中呈顯著改變[4]。既往研究僅限于以上極少數細胞因子分析，缺乏系統性和全面性。本研究旨在利用蛋白組學方法系統觀察卒中后急性期患者血漿中120種細胞因子水平與卒中后2周時PSD發生之間的關系，為PSD的細胞因子發病假說提供臨床證據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 研究對象均來自于2010年10月～2011年3月入住于我院神經內科的急性缺血性卒中患者，隨訪至卒中后2周，依據美國精神病學會《精神障礙診斷和統計手冊》第4版（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-Ⅳ，DSM-Ⅳ）[5]標準診斷PSD，即患者必須同時表現心境低落，或興趣或快感缺失以及至少4項其他抑郁癥狀，并持續2周以上。入組標準：①發病后3 d內入院的急性缺血性卒中患者；②年齡大于18歲；③卒中診斷符合1995年全國第4屆腦血管病學術會議制定的《各類腦血管病診斷要點》[6]中有關腦梗死的診斷標準，并均經頭顱磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）證實；④隨機選擇符合PSD診斷及非PSD患者各12例納入本實驗進行細胞因子蛋白水平檢測；⑤患者本人及家屬簽署書面知情同意書。

排除標準：①因意識、視力、聽力、嚴重語言表達及理解障礙，無法完成檢查者；②合并腦出血、蛛網膜下腔出血及短暫性腦缺血發作患者；③伴有帕金森病、癲癇、神經系統脫髓鞘疾病患者；④伴有嚴重軀體疾病者，包括心肝腎功能不全、休克、惡性腫瘤或血液病、自身免疫性疾病等；⑤既往有抑郁癥病史及器質性精神疾病病史，近1年內有重大精神創傷史者；⑥近1個月內有藥物、酒精及其他物質依賴或濫用者；⑦近1個月內發生感染或傳染性疾病者。

住院期間，所有患者均行頭顱MRI檢查，以彌散加權像（diffusion-weighted imaging，DW I）序列所見明確急性梗死病灶為標準，測定梗死中心距額極直線距離。利用公式（a×b×c×0.5）/2[7]計算梗死灶體積（單位：cm3），其中a為梗死面積最大層面上病灶的最大橫徑，b為梗死面積最大層面上病灶的最大長徑，c為梗死病灶累計層數，層厚為0.5 cm。影像學指標測量及計算由兩名影像專業主治醫師進行，取其平均值。

所有納入本研究的卒中患者均接受了同等劑量抗血小板聚集藥物治療（阿司匹林100 mg/d）。本研究經東南大學醫學倫理委員會審核批準。

1.2 臨床資料收集及評估 本研究小組由經過培訓的神經內科和精神科醫生組成，所有的臨床量表評估及PSD診斷均由2名高年資醫師共同完成，如存有異議時會商確定。收集及評估以下臨床資料：①一般資料：現病史、既往史、卒中危險因素包括高血壓[8]、糖尿病[9]、卒中病史[6]、吸煙、飲酒史等。本研究中根據世界衛生組織（World Health Organization，WHO）關于吸煙情況調查方法的標準化建議將吸煙定義為：每天吸煙卷1支以上，連續或累計6個月[10]； 飲酒定義為：每周至少1次，連續6個月以上飲酒者；②神經功能評估：入院時及發病2周后兩次進行神經功能評估，以美國國立衛生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）評定神經功能缺損程度，Barthel指數評估功能殘疾水平；③認知功能：卒中后2周，以簡易精神狀態檢查量表（Mini-Mental State Examitation，MMSE）評定認知功能；④抑郁癥狀：卒中后2周，分別以漢密爾頓抑郁量表（the 17-item Hamilton Depression Rating Scale，HAMD）及漢密爾頓焦慮量表（Hamilton Anxiety Scale，HAMA）評估患者抑郁癥狀及焦慮癥狀嚴重程度。

1.3 血漿細胞因子抗體芯片測定 患者入院后1 d清晨［卒中后（1.5±0.9）d］空腹留取靜脈血4 ml，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetie acid，EDTA）試管抗凝，3000 rpm離心20 min，留取并分裝血漿樣本，凍存于－80℃冰箱待檢。利用人類細胞因子蛋白表達微陣列芯片（Human Cytokine Antibody Array G-Series 1000）進行血漿中共120種細胞因子蛋白水平檢測，以質控血漿做重復檢驗，檢測峰值及強度的變異系數均控制在誤差范圍內。并隨機挑取10%細胞因子以酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immuno-sorbent assay，ELISA）進行驗證檢測，對實驗室檢測者及結果觀測者均實行盲法（北京博奧生物有限公司）。

1.4 統計學處理 使用SPSS 17.0對數據進行統計分析，組間計數資料的比較采用χ2檢驗，計量資料采用單樣本K-S正態性檢驗，對符合正態分布的資料，以均值±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；對不符合正態分布的資料，以中位數（四分位數范圍）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。細胞因子抗體芯片信號強度經標準化后，點信號強度（spot signal intensity，SIs）表達差異＞1.5倍者，以Mann-Whitney U檢驗比較兩組之間信號強度差別，QValue 1.0軟件進行錯誤發現率（false discovery rate，FDR）多重校正。采用二元多因素Logistic向前逐步回歸分析法評估細胞因子對卒中后急性期PSD發病的影響。正態性資料采用Pearson相關分析，非正態性資料采用Spearman非參數相關檢驗進行各因素間關聯分析。以P＜0.05為差異具有顯著性。

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2 結果

2.1 PSD組與非PSD組一般臨床資料比較 PSD組與非PSD組一般人口學資料、既往病史、病灶特征、神經功能比較均無顯著性差異。兩組患者卒中后兩周HAMD評分（P＜0.001）及HAMA評分（P＜0.001）差異均有顯著性（表1）。

2.2 PSD組與非PSD組血漿細胞因子蛋白水平比較 120種血漿細胞因子中，巨噬細胞炎癥蛋白-3β（macrophage inflammatory protein-3 beta，MIP-3 beta）、胰島素樣生長因子1受體（insulinlike growth factor 1 receptor，IGF-I SR）、胎盤生長因子（placental growth factor，PIGF）及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）4種細胞因子蛋白SIs在PSD組明顯低于非PSD組，單因素分析中具有統計學差異，但均未能通過多重校正（表2）。

2.3 PSD相關細胞因子的多因素Logistic回歸分析 將單因素分析有統計學意義的4種血漿細胞因子引入回歸方程中，多因素Logistic回歸分析結果未發現任何細胞因子蛋白SIs與卒中后兩周PSD發生獨立相關。

2.4 細胞因子蛋白SIs與抑郁、焦慮嚴重程度的相關性分析 PSD患者血漿IGF-I SR SIs與入院時Barthel指數評分呈顯著負相關（r=－0.641，P=0.025）（圖1），與卒中后兩周HAMD（r=0.478，P=0.005）及HAMA評分（r=0.674，P=0.016）呈顯著正相關（圖2）。未發現其他因子與焦慮或抑郁嚴重程度有相關性。

3 討論

本研究系統觀察并分析了缺血性卒中患者急性期血漿120種細胞因子蛋白水平與卒中2周后PSD發生的關系。研究結果提示，在單因素分析中，PSD患者卒中后急性期血漿中4種細胞因子蛋白SIs顯著低于非PSD患者，且血漿IGF-I SR SIs與入院時神經功能缺損程度及卒中2周后抑郁、焦慮嚴重程度均存在顯著相關性。

表1 PSD組和非PSD組人口學資料及一般臨床資料比較

表2 PSD組和非PSD組血漿差異表達細胞因子點信號強度比較

圖1 卒中后抑郁患者血漿胰島素樣生長因子1受體蛋白（IGF-I SR）點信號強度與入院時Barthel指數評分呈負相關統計圖

圖2 卒中后抑郁患者血漿胰島素樣生長因子1受體蛋白（IGF-I SR）點信號強度與入院后2周漢密爾頓抑郁量表（HAMD）及漢密爾頓焦慮量表（HAMA）統計圖。圖A為IGF-I SR點信號強度與入院后2周HAMD呈正相關統計圖；圖B為IGF-I SR點信號強度與入院后2周HAMA呈正相關統計圖

細胞因子是一類能在細胞間傳遞信息、具有免疫調節和效應功能的蛋白質或小分子多肽的總稱，根據細胞因子主要的功能可分為白細胞介素、集落刺激因子、干擾素、腫瘤壞死因子、轉化生長因子-β家族、生長因子、趨化因子家族共7大類[11]。但目前對于PSD與細胞因子之間的研究多限于IL-6、IL-18、TNF-α等少數促炎因子[4]，缺乏各類細胞因子全面、同步、系統的研究結果。以細胞因子抗體芯片技術為依托的蛋白組學技術，具有快速、簡易、高通量的優點，為篩選與疾病相關的潛在細胞因子生物學標志物提供了良好平臺[12-13]。本研究嚴格篩選了符合入組標準的卒中急性期PSD患者作為研究對象；細胞因子蛋白芯片的自動操作，避免了人為的操作誤差；質控血漿、檢測變異系數的嚴格控制及隨機樣本的平行重復驗證確保了檢測準確性，以上均為本研究結果的可靠性提供了良好保障。

本研究發現4種細胞因子蛋白SIs在PSD組明顯低于非PSD組。值得關注的是，除MIP-3 beta參與炎癥反應外，另外3種均歸屬于生長因子亞族，分別為PIGF、VEGF及IGF-I SR。已有研究證實，VEGF與PIGF具有高度同源堿基序列，PIGF作為一種分泌型同型二聚體糖蛋白，因最初在人類胎盤中發現而命名，被認為是VEGF家族中的一員，二者功能具有相似性[14]。

此外，本研究還發現IGF-I SR蛋白血漿SIs在PSD組顯著低于非PSD組，且PSD患者血漿IGF-I SR蛋白信號強度越高，入院時神經功能缺損程度及2周后抑郁、焦慮癥狀越重。IGF-I是由70個氨基酸殘基組成的多肽，主要在肝臟合成，IGF-I可以穿過血腦屏障與其受體相結合。其受體IGF-I SR主要分布在大腦皮質的表層和深層，嗅球，丘腦核和海馬等處，神經元突觸結構亦表達IGF-I SR，具有促進細胞增殖、分化等多種生物活性[21-22]。此前IGF-I SR與精神分裂癥的關系已引起學者的關注[23]，李則摯等[24]和易正輝等[25]利用全基因組外周血基因表達譜芯片分析顯示IGF-I SR基因在亞綜合征抑郁（subsyndromal symptomatic depression，SSD）中表達下降，且SSD患者外周血IGF-I SR基因mRNA表達水平比正常對照組降低17.63%，有統計學差異。以上發現與本研究結果相一致，進一步證實IGF-I SR與抑郁發病相關。此外，更有學者指出，IGF-I與腦源性神經營養因子協同使用具有更顯著的促進海馬再生及抗抑郁效果，甚至有研究發現，腦源性神經營養因子抗抑郁療效具有IGF-I依賴性[26]。

本研究存在一定局限性。首先，樣本量偏小，導致統計效力不足；其次，隨訪期僅至卒中后2周，對PSD的診斷存在一定時間局限性；第三，卒中急性期細胞因子干擾因素復雜，可能造成檢測結果偏倚。

綜上所述，本研究初步探討了缺血性卒中后急性期血漿細胞因子水平與卒中后2周時PSD發生的關系。結果提示，PSD患者卒中后急性期血漿中4種細胞因子蛋白表達水平異常，但未能通過多重校正。因此，卒中急性期血漿細胞因子水平尚不能作為預測PSD發生的獨立危險因素，但3種生長因子水平的異常提示PSD可能存在突觸可塑及神經再生障礙。本研究結論尚需在大樣本研究中進一步驗證。

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