丹參酮ⅡA對(duì)局灶性腦缺血大鼠急性期腦保護(hù)作用的相關(guān)研究

劉玲玲，劉紅，尹君玲，陳惠英，劉曉蕾，焦清海，武一平

缺血性腦血管病急性期細(xì)胞啟動(dòng)多種防御機(jī)制[1-2]以保護(hù)神經(jīng)元免受缺血性損傷。目前已知一些轉(zhuǎn)錄因子與神經(jīng)細(xì)胞的存活相關(guān)，其中最重要的是環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cyclic adenosine monophosphate response element binding protein，CREB）家族，許多細(xì)胞外刺激均能夠通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將信號(hào)由胞膜傳到細(xì)胞核內(nèi)，激活CREB，使其磷酸化，成為磷酸化CREB（phospho-CREB，p-CREB）。它的基因產(chǎn)物調(diào)節(jié)著神經(jīng)元在應(yīng)激性損傷后的再生、存活和修復(fù)[3]。CREB活性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)導(dǎo)子[4]（transducers of regulated CREB，TORCs）是新發(fā)現(xiàn)的一類強(qiáng)有力的CREB的共激活因子，TORC1是其中唯一一個(gè)在腦中高表達(dá)的亞型，近年來(lái)，TORC1對(duì)CREB-CRE通路的調(diào)控作用已成為研究的熱點(diǎn)之一[5-6]。丹參酮ⅡA（Tanshinone IIA，TSA）是臨床上常用的中草藥丹參的一種有效成分，通過(guò)TSA的應(yīng)用，觀察其對(duì)腦梗死后急性期的腦保護(hù)作用及對(duì)TORC1和p-CREB表達(dá)的影響，從而探討TSA與CREB-CRE通路之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠48只，體重250～300 g，由河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要儀器和試劑 凝膠掃描分析系統(tǒng)（美國(guó)Syngene公司），光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司），2，3，5-三苯基四唑氮紅（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）（美國(guó)Sigma公司），兔抗大鼠TORC1單克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling公司），兔抗大鼠p-CREB單克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling公司），熒光標(biāo)記羊抗兔二抗（深圳Rockland公司），TSA（中國(guó)西安Huike植物開發(fā)有限公司），蛋白提取試劑盒（北京普利萊公司），TSA溶液（用0.9%的生理鹽水配制，濃度為20 mg/ml和10 mg/ml兩種）。

1.3 分組、模型制備及藥物處理 ①分組：將48只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、對(duì)照組、大劑量TSA組和小劑量TSA組，每組12只。②模型制備：參照Longa等[7-9]的線栓法制作大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。以10%水合氯醛（30 mg/kg）腹腔麻醉，碘伏消毒，頸部正中切口分離結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，頸外動(dòng)脈近心端備線，用動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈分叉處剪0.2 mm的切口，插入直徑0.2 mm的尼龍線沿頸內(nèi)動(dòng)脈入顱，進(jìn)線長(zhǎng)度約距頸總動(dòng)脈分叉處（18.5±0.5）mm，遇阻即止，線栓正好插至顱內(nèi)的大腦前動(dòng)脈，阻斷大腦中動(dòng)脈的所有血供來(lái)源。固定線栓，縫合皮下組織和皮膚。假手術(shù)組除不在頸內(nèi)動(dòng)脈插入線栓外，其余步驟與另3組均相同。③藥物處理：術(shù)后所有大鼠的藥物均采用腹腔注射。大劑量TSA組根據(jù)大鼠體重注射TSA-H，劑量為20 mg/kg；小劑量TSA組注射TSA-L時(shí)用醫(yī)用生理鹽水原藥稀釋一倍，注射劑量為10 mg/kg；假手術(shù)組和對(duì)照組注射等量的生理鹽水。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)分 大鼠在麻醉剛醒時(shí)，采用以Longa評(píng)分改良6分法[7]進(jìn)行評(píng)分：0分-沒(méi)有神經(jīng)功能缺損；1分-大鼠對(duì)側(cè)（癱瘓側(cè)）前肢不能完全伸展；2分-對(duì)側(cè)（癱瘓側(cè)）前肢不能伸展；3分-稍往對(duì)側(cè)（癱瘓側(cè)）轉(zhuǎn)圈（轉(zhuǎn)大圈）；4分-向?qū)?cè)（癱瘓側(cè)）明顯轉(zhuǎn)圈（轉(zhuǎn)小圈）；5分-行走時(shí)大鼠向?qū)?cè)（癱瘓側(cè)）傾倒。除假手術(shù)組均選取2～5分作為成功模型，造模不成功組補(bǔ)充大鼠。

1.5 腦梗死體積百分比測(cè)定 每組取6只大鼠進(jìn)行腦梗死體積測(cè)定。大鼠在造模成功后24 h，斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，稱質(zhì)量后將腦組織行冠狀切片。然后迅速將腦片置5 ml含有2%TTC的磷酸緩沖溶液中，37℃避光溫孵30 min，經(jīng)染色后，正常腦組織呈玫瑰紅色，而腦梗死部分呈白色，且界限分明。腦梗死體積測(cè)算方法[10]，總梗死體積=總梗死面積×腦片的厚度，水腫修正后梗死體積=對(duì)側(cè)半球梗死體積－（損傷側(cè)半球體積－損傷側(cè)半球梗死體積），梗死體積百分比（%）=修正后梗死體積/對(duì)側(cè)半球體積。

1.6 應(yīng)用Western blotting檢測(cè)TORC1和p-CREB的表達(dá) 每組分別取大鼠6只（包括用于萃取頂葉梗死區(qū)腦神經(jīng)細(xì)胞p-CREB和TORC1核蛋白的3只，萃取TORC1細(xì)胞總蛋白的3只）。

1.6.1 標(biāo)本的采集 各組大鼠在規(guī)定時(shí)間的治療觀察完成后，麻醉后取出腦組織，在冰盤上剝離大腦中動(dòng)脈閉塞側(cè)，放于－70℃冰箱內(nèi)備用。

1.6.2 蛋白提取[8-9]按照總蛋白提取試劑盒說(shuō)明操作提取測(cè)定總蛋白。取50 mg腦組織，轉(zhuǎn)移到離心管中，加入500 μl裂解液，5 μl蛋白磷酸酶抑制劑混合物，組織剪剪碎組織，后用高速機(jī)械勻漿器破碎組織；取0.5 ml組織勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，棄去剩余的組織勻漿液，加入2倍體積的抽提試劑及10 μl蛋白磷酸酶抑制劑混合物充分混勻，后4℃靜置10 min，偶爾晃動(dòng)；10 000 g 4℃離心10 min，溶液分為上下兩相，兩相中間為蛋白膜，吸除上層液體，后用吸頭輕輕撥開蛋白膜，吸除下層液體，蛋白膜將附著于離心管壁上。加入2%十二烷基硫酸鈉水溶液及1∶100體積比例的蛋白磷酸酶抑制劑混合物，95℃煮10 min，至蛋白膜溶解，后用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒，在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定蛋白濃度。

按照細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒說(shuō)明操作抽提細(xì)胞核蛋白。50 mg組織，剪成小塊，磷酸鹽緩沖液沖洗，旋轉(zhuǎn)棄去磷酸鹽緩沖液。加入0.5～1 ml細(xì)胞質(zhì)抽提緩沖液A（冰上）。4℃玻璃勻漿器中，勻漿組織20沖程，或直到在顯微鏡可見90﹪細(xì)胞破壞或裸核。4℃1000 g離心5 min，碎片包含裸核。為了除去細(xì)胞膜成分，做以下步驟：在100 μl的細(xì)胞質(zhì)抽提緩沖液A液中，使核碎片再次懸浮，向其中加入5 μl細(xì)胞質(zhì)抽提緩沖液B液，渦旋10 s，在冰上孵育1 min，1000 g離心5 min，收集核碎片，棄上清。100 μl細(xì)胞質(zhì)抽提緩沖液A沖洗核碎片，1000 g轉(zhuǎn)5 min，旋轉(zhuǎn)，棄上清。向核碎片中加入70～100 μl核抽提緩沖液，渦旋（冰上），冰上孵育30 min，每5 min渦旋10 s。4℃離心12 000 g 5 min。上清液部分含有抽提的細(xì)胞核蛋白，將上清液轉(zhuǎn)移至新管中，－70～－20℃保存。

1.6.3 蛋白電泳及檢測(cè) 取出等質(zhì)量的樣品蛋白（30 μg）冰上裂解、勻漿、離心，取上清以考馬斯亮藍(lán)G250結(jié)合法測(cè)定樣品蛋白含量，等量蛋白樣品經(jīng)12%的聚丙烯酰胺凝膠分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉4℃過(guò)夜，加抗TORC1和p-CREB一抗工作液（兔抗大鼠TORC1單克隆抗體，1∶1000；兔抗大鼠p-CREB單克隆抗體，1∶500）室溫振搖2 h，加入熒光標(biāo)記的二抗工作液（熒光標(biāo)記羊抗兔二抗，1∶6000，Rockland）室溫振搖1 h。以上各步驟間用磷酸鹽緩沖液洗10 min×3次。暗室曝光-顯影-定影，X線片用Cheni Imager 5500 V2103軟件掃描，用Fluor Chen210軟件進(jìn)行定量分析得到積分吸光度（integrated absorbency，IA）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性分析，符合正態(tài)分布者采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析和兩組間的比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 大鼠梗死體積百分比比較 本研究中有造模未成功的大鼠，已去除。造模成功后，干預(yù)組無(wú)大鼠死亡。對(duì)照組、小劑量TSA組和大劑量TSA組腦梗死體積比分別為（43.54±3.22）%、（40.26±2.30）%和（34.49±1.39）%；3組大鼠組間差異均有顯著性（F=10.744，P=0.010）；大劑量TSA組梗死體積百分比低于對(duì)照組，差異有顯著性（q=5.76，P=0.004）；小劑量TSA組梗死體積百分比與對(duì)照組相比，差異無(wú)顯著性（q=2.09，P=0.148）。大劑量TSA組梗死體積百分比與小劑量TSA組相比，差異有顯著性（q=3.68，P=0.027）（表1）。

2.2 大鼠TORC1和p-CREB的蛋白表達(dá)情況比較 4組大鼠細(xì)胞核TORC1蛋白（F=25.742，P＜0.001）、細(xì)胞TORC1蛋白（F=23.85，P＜0.001）和細(xì)胞核p-CREB蛋白表達(dá)（F=36.65，P＜0.001）情況如表2，組間差異均有顯著性。

與對(duì)照組相比，假手術(shù)組的細(xì)胞核TORC1、細(xì)胞核p-CREB和細(xì)胞TORC1蛋白的表達(dá)差異均有顯著性，q值分別為3.54、4.39及7.13，P值分別為0.047，0.027和＜0.001；與對(duì)照組相比，大劑量TSA組中細(xì)胞核TORC1、細(xì)胞核p-CREB和細(xì)胞TORC1的蛋白表達(dá)均增高，q值分別為10.12、8.55及9.33，P均＜0.001；與對(duì)照組相比，小劑量TSA組只有細(xì)胞核p-CREB和細(xì)胞TORC1的蛋白表達(dá)具有顯著性，q值分別為6.31，6.75，P值分別為0.002和0.001；細(xì)胞核TORC1的蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異，q=2.87，P=0.083。

大劑量TSA組和小劑量TSA組細(xì)胞核TORC1的蛋白表達(dá)差異有顯著性，q=6.12，P=0.003。大劑量TSA組和小劑量TSA組細(xì)胞TORC1的蛋白表達(dá)差異有顯著性，q=5.33，P=0.010。大劑量TSA組和小劑量TSA組，細(xì)胞核p-CREB的蛋白表達(dá)的劑量高低無(wú)組間差異，q=1.39，P=0.838。

3 討論

缺血性腦損害涉及一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，數(shù)分鐘內(nèi)即可發(fā)生細(xì)胞毒反應(yīng)[11-12]，但同時(shí)也激活了內(nèi)源性修復(fù)過(guò)程，從而抵抗神經(jīng)組織過(guò)度損傷[13]。

CREB是位于神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，缺血性腦損害可通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將信號(hào)由胞膜傳到細(xì)胞核內(nèi)，激活CREB，使其成為p-CREB。通過(guò)激活p-CREB/CRE通路介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、分化、再生[5-6]。

表1 三組梗死體積百分比均數(shù)兩兩比較的q值及P值

表2 各組大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞核TORC1、p-CREB及腦神經(jīng)細(xì)胞TORC1蛋白水平

TORC1作為一類強(qiáng)有力的CREB的共激活因子，未激活狀態(tài)下處于磷酸化狀態(tài)，位于細(xì)胞質(zhì)中，唯有去磷酸化狀態(tài)下的TORC1才可以穿過(guò)核膜進(jìn)入細(xì)胞核，與p-CREB相結(jié)合后再與帶有CRE序列的基因結(jié)合，促進(jìn)下游基因的轉(zhuǎn)錄活性[4，6，14]，在神經(jīng)組織修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5-6，8-9，15-17]。Sasaki等[17]通過(guò)小鼠體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后，細(xì)胞核內(nèi)TORC1-CREB通路被激活，導(dǎo)致p-CREB及其下游靶基因的活化，促進(jìn)了皮質(zhì)神經(jīng)元的修復(fù)。本研究為大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TSA在大鼠腦梗死急性期上調(diào)了缺血區(qū)頂葉皮質(zhì)TORC1-CREB通路的蛋白表達(dá)，同時(shí)減小了梗死區(qū)的體積，具有腦保護(hù)作用。

TSA是丹參的關(guān)鍵成分之一，是從丹參的干燥的根和根莖中提取的，是菲醌派生物。近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道，TSA具有天然抗氧化、抗腫瘤、抗炎及保肝等多方面的藥理作用[18-22]，它的神經(jīng)保護(hù)作用與TORC1-CREB通路在腦缺血后的基因產(chǎn)物有關(guān)，如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[6，8]（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病2[23]（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）等，BDNF是一種神經(jīng)保護(hù)因子，Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，均能夠在腦缺血損傷時(shí)起到腦保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予不同劑量的TSA對(duì)腦組織梗死的體積比和各因子蛋白表達(dá)的影響不同。與對(duì)照組相比，TSA干預(yù)后，細(xì)胞質(zhì)中的TORC1激活后轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致TORC1核蛋白表達(dá)增多，TORC1-CREB通路激活，從而上調(diào)了早期保護(hù)性基因的表達(dá)，使腦組織梗死體積比下降，而且這種梗死體積比變化的程度與TSA的劑量有關(guān)。

本研究具有一定局限性。實(shí)驗(yàn)中各項(xiàng)指標(biāo)的樣本量較小，只觀察了一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，沒(méi)有對(duì)TSA干預(yù)后大鼠長(zhǎng)期神經(jīng)預(yù)后進(jìn)行觀察，也沒(méi)有對(duì)各細(xì)胞因子在干預(yù)后的時(shí)間變化進(jìn)行分析，在以后的研究中我們會(huì)進(jìn)一步探討TSA在大鼠腦缺血模型中的時(shí)間和劑量效應(yīng)。

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