α－常春藤皂苷丙烯酸樹脂L100－55納米粒的制備及體外評價

李 穎，尹紅然，耿麗娟，游本剛

（1.蘇州大學醫學部藥學院，江蘇蘇州215123；2.蘇州市產品質量監督檢驗所，江蘇蘇州215104）

·制劑研究·

α－常春藤皂苷丙烯酸樹脂L100－55納米粒的制備及體外評價

李 穎1，2，尹紅然1，耿麗娟1，游本剛1

（1.蘇州大學醫學部藥學院，江蘇蘇州215123；2.蘇州市產品質量監督檢驗所，江蘇蘇州215104）

目的采用腸溶材料丙烯酸樹脂L100－55作為載體材料，制備α－常春藤皂苷丙烯酸樹脂納米粒（SPD－L100－55－NPs）并進行體外評價。方法采用改良乳化溶劑擴散法制備SPD－L100－55－NPs，以粒徑、包封率（EE）和多分散指數（P.I.）為綜合指標，通過單因素實驗和正交設計實驗優化納米粒的處方工藝，以紅外光譜（FT－IR）、X射線衍射（XRD）、差示掃描量熱分析（DSC）等對制備的納米粒進行評價，并考察其體外釋放特性。結果制得的SPD－L100－55－NPs納米粒外觀圓整、分布均勻，平均粒徑為（63.5±3.6）nm，包封率為98.91%± 0.18%，P.I.為0.198±0.014。藥物在納米粒中被載體材料有效包裹，體外釋放具有緩釋特性和pH依賴性。結論所制得的納米粒圓整均勻、包封率高，在體外具有良好的緩釋特性和pH敏感性。

α－常春藤皂苷；丙烯酸樹脂（L100－55）；納米粒；釋放

α－常春藤皂苷［1］（saponins PD，SPD）是從中藥預知子［2］中提取的三萜皂苷類化合物，具有保肝護肝［3～6］、抗腫瘤［7］等多種藥理活性，但SPD難溶于水，口服吸收差，體內生物利用度較低，且對黏膜有較強的刺激性。丙烯酸樹脂具有安全、無毒，理化性能穩定，不被吸收和代謝等優點，在降低藥物毒副作用，提高生物利用度和療效等方面具有重要意義［8］。本研究以腸溶材料丙烯酸樹脂Eudragit L100－55為載體材料，制備α－常春藤皂苷丙烯酸樹脂L100－55納米粒，以期降低藥物毒副作用并提高其生物利用度。

1 材料與儀器

1.1 材料 α－常春藤皂苷（自制，純度90%以上）；α－常春藤皂苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：111880－201001）；丙烯酸樹脂L100－55（德國羅姆公司）；泊洛沙姆F68（深圳市優普惠實業發展有限公司）；乙腈為色譜純，甲醇等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 納米粒度和Zeta電位分析儀（NICOMP 380ZLS，Santa Barbara，USA）；LC－15C高效液相色譜儀（日本島津公司）；HPP－5001激光粒度分析儀（英國Malvern公司）；Optima max超速冷凍離心機（美國Beckman公司）；真空冷凍干燥機（Lg－5A，上海離心機械研究所）；H600透射電子顯微鏡（日立公司，日本）；X′Pert－Pro MPD X射線多晶衍射儀（荷蘭帕納科公司）；SDT 2960熱分析儀（美國TA Instruments公司）；MagnaIR550型紅外光譜儀（美國Nicolet公司）。

2 方法與結果

2.1 SPD的含量測定

2.1.1 HPLC色譜條件 色譜柱：Cosmosil C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；流動相：乙腈－水－磷酸（42∶58∶0.1）；流速：1 mL·min－1；檢測波長：203 nm；柱溫：35℃；進樣量：20μL。

2.1.2 標準曲線的繪制 精密稱取SPD對照品10.04 mg，于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成濃度100.40μg·mL－1的標準貯備液。

分別精密量取SPD貯備液配制成濃度0.502、5.02、10.04、20.08、40.16、80.32μg·mL－1的標準溶液，按上述色譜條件，取20μL進樣，記錄藥物峰面積。以峰面積（A）對質量濃度（C）進行線性回歸，得線性方程為：A＝6 533.2C－1 201.9，r＝0.999 9（n＝5），在0.502～80.32μg·mL－1質量濃度范圍內線性關系良好。

2.1.3 精密度 分別取低（0.502μg·mL－1）、中（20.08μg·mL－1）、高（80.32μg·mL－1）3個濃度的樣品溶液，一天內重復測定5次，連續測定5 d，SPD的日內、日間RSD均＜2%，符合要求。

2.1.4 回收率 取空白納米粒膠體溶液1 mL，分別加入0.05、2、8 mL的SPD標準母液，加甲醇適量于超聲機中超聲消解，靜置后，用甲醇定容至10 mL，過0.45μm微孔濾膜，HPLC進樣20μL，測定SPD的濃度，代入標準曲線方程，得低、中、高濃度的回收率：100.60%±1.92%、97.78%±1.25%和99.00%±1.09%。

2.2 SPD－L100－55－NPs的制備

2.2.1 SPD－L100－55－NPs膠體溶液的制備采用改良乳化－溶劑擴散法［9］制備SPD－L100－55－NPs。稱取L100－55與SPD溶解于無水乙醇中，作為有機相；另取F68溶于蒸餾水作為水相。在水浴和磁力攪拌下，將有機相快速注入水相中，攪拌反應一段時間后，轉入到高溫度水浴中，繼續攪拌以揮發有機溶劑，經0.45μm微孔濾膜過濾，即得納米粒膠體溶液。

2.2.2 SPD－L100－55－NPs凍干粉的制備 取SPD－L100－55－NPs膠體溶液，超濾濃縮至原體積的十分之一。取10%甘露醇溶液1 mL加入到3 mL上述納米粒濃縮液中，混勻，分裝于西林瓶中，至－70℃低溫冰箱，冷凍24 h，迅速轉入真空冷凍干燥機中，干燥28 h后即得。

2.3 納米粒的質量評價

2.3.1 粒徑和多分散系數的測定 取適量納米粒膠體溶液用激光散射粒度分析儀測定粒徑和多分散系數（P.I.）。

2.3.2 包封率的測定 取適量新鮮制備的SPDL100－55－NPs膠體溶液置于離心管中，低溫超速離心45 min（30 000 rpm，4℃），分取20μL上層清液進樣，測定，經換算即得游離藥量；取1mL納米粒膠體溶液加入甲醇超聲消解后，取20μL進樣，經換算得納米粒溶液中SPD含量即為總投藥量。按下列公式計算納米粒的包封率（EE）。

2.4 單因素考察納米粒的制備工藝 通過考察丙烯酸樹脂L100－55用量（100 mg）、SPD用量（40 mg）、有機相／水相比例（1∶5）、F68用量（200 mg）、攪拌速度（500 rpm）、揮發時間及溫度（3 h，50℃）、針頭大小及注入速度（7＃，15 s）等因素，以EE、平均粒徑和P.I.為指標，初步篩選制備納米粒的處方及工藝條件。括號中數據為考察其他因素時該因素的固定水平，若單因素考察后結果與所固定得數據相左，則選用考察后的較優水平。

2.4.1 丙烯酸樹脂L100－55用量的考察 L100－55分別稱取100、125、150、175、200 mg，制備納米粒，結果見表1。隨著L100－55用量增加，粒徑逐漸增大，P.I.先減小后增大，EE則減小，故其用量不宜過大，在100～150 mg時較優。綜合考慮，L100－55用量為125 mg較為適宜。

表1 L100－55用量的考察

2.4.2 SPD用量的考察 SPD分別取10、20、30、40、50 mg，制備納米粒，結果見表2。隨著SPD用量的增加，納米粒粒徑變化不是太大，P.I.值先增大后降低，EE逐漸增大后變化不大，故SPD用量可適當增加，暫定SPD用量為50 mg。

表2 SPD用量的考察

2.4.3 有機相／水相的考察 無水乙醇／水的比例分別為0.5∶5、1∶5、1.5∶5、2∶5，其中水相為50 mL不變，制備納米粒，結果見表3。由表可見，在1∶5～2∶5之間，EE變化不大，納米粒粒徑和P.I.值都增大，故選取有機相／水相比例為不宜過大，初步確定比例為1∶5。

表3 有機相／水相比例的考察

2.4.4 F68用量的考察 分別取50、100、150、200、250、300 mg的F68，制備納米粒，結果如表4。可見F68在100～250 mg范圍內形成的納米粒較多，粒徑分布均勻。綜合考慮，F68用量確定為200 mg。

表4 F68用量的考察

2.4.5 揮發時間的考察 在50℃條件下，考察有機相揮發時間，制備納米粒，結果如表5。可知有機溶劑在揮發溫度在50℃、揮發時間為3 h時，粒徑較小，EE高，P.I.值較小，粒徑分布較集中。

表5 揮發時間的考察

2.4.6 注入速度與針頭大小的考察 分別用三種型號針頭，三種注入速度將有機相勻速注入水相，制備納米粒，結果見表6。由此可知針頭大小和注入速度對EE和粒徑影響不大，選取較小的P.I.值，故有機相選用7＃針頭在15 s內勻速注入。

表6 注入速度與針頭大小的考察

2.4.7 轉速的考察 在不同磁力攪拌速度下，制備納米粒，結果見表7。可知轉速對EE影響較小，對粒徑、P.I.值有影響，故轉速選用較優的500 rpm。

表7 轉速的考察

2.5 正交設計優化SPD－L100－NPs制備工藝

綜合單因素考察的數據，選取了A：SPD用量、B：有機相／水相比例和C：F68用量三個影響較大的因素，每個因素選擇3個水平，使用L9（33）正交表（表8）進行正交設計試驗。以a：EE、b：平均粒徑和c：P.I.為指標，分別給3個指標0.5、0.3、0.2的權重，采用綜合加權評分法［10，11］，由于平均粒徑、P.I.越小越優，所以綜合評分＝a／amax×100×0.5＋bmin／b ×100×0.3＋cmin／c×100×0.2，結果見表9。

表8 正交設計因素水平表

表9 正交實驗結果

表10 方差分析表

通過直觀分析，各因素對指標的影響大小順序依次為A＞B＞C，三因素的最佳組合為A1B3C1，即SPD用量為50 mg、F68用量為250 mg、有機相與水相的比例為1∶5。方差分析結果（表10）表明，A因素即SPD用量各水平間具有顯著性差異（P＜0.05）。

2.6 驗證實驗 稱取125 mg丙烯酸樹脂L100－55與50 mg的SPD溶解于10 mL無水乙醇中，超聲溶解后，作為有機相；另將250 mg泊洛沙姆188溶于50 mL蒸餾水中作為水相。在30℃水浴、500 rpm磁力攪拌下，將有機相快速注入水相中，繼續攪拌反應10 min后，轉入到60℃水浴中，攪拌3 h以揮發有機溶劑，經0.45μm微孔濾膜過濾，即得SPD－L100－55－NPs膠體溶液。平行制備3批SPDL100－55－NPs，各項指標見表11，粒徑分布見圖1。測得包封率98.91%±0.18%，平均粒徑（63.5± 3.6）nm，P.I.值0.198±0.014，綜合評分98.92，均優于正交實驗中的9個處方工藝。

表11 優化工藝制備的納米粒的各項指標

圖1 SPD－L100－55－NPs粒徑分布圖

2.7 SPD－L100－55－NPs納米粒的表征

2.7.1 納米粒形態觀察 將SPD－L100－55－NPs膠體溶液點樣于銅網上，經2%的磷鎢酸復染后，用濾紙吸干染液，自然干燥后，置于透射電鏡下觀察。納米粒的透射電鏡照片見圖2，可見納米粒形態圓整，粒徑分布集中，且與激光粒度分析儀的測定結果相近。

圖2 SPD－L100－55－NPs透射電鏡照片

2.7.2 FT－IR分析 取L100－55、SPD、SPDL100－55物理混合物、Fd－SPD－L100－55－NPs加入適量KBr壓片，測得如圖3的紅外譜圖。L100－55曲線中有兩個特征峰：3 499 cm－1ν（－OH），1 753 cm－1δ（－C＝O）。NPs中的O－H伸縮振動吸收峰紅移至3 305 cm－1處，向低波數位移了194 cm－1，這表明形成了一定強度的分子內和分子間氫鍵；1 753 cm－1處的尖峰強度降低，并有新的吸收峰出現。表明形成了新的物相，掩蓋了藥物峰，藥物被包裹形成納米粒。

圖3 紅外光譜圖

2.7.3 DSC分析 分別稱取L100－55、SPD、SPD－L100－55物理混合物、Fd－SPD－L100－55－NPs約1.0 mg。測試條件：采用熱流型測量方法，以空白鋁坩堝為參比物，掃描速度為20℃·min－1，掃描范圍為0～300℃。得到熱流型DSC曲線，見圖4。NPs的DSC曲線在158.11和168.45℃處分別出現一新的吸熱峰，且SPD（63.47、221.55℃）、S100（68.66、217.06℃）和SPD－L100－55 Mixture（70.78、222.03℃）的原吸熱峰被掩蓋或被削弱，與NPs曲線有顯著的不同，表明生成了新的物相，即有納米粒形成，結果與FT－IR一致。

圖4 DSC曲線圖

2.7.4 XRD分析 對L100－55、SPD、SPD－L100－55物理混合物、Fd－SPD－L100－55－NPs進行X衍射。條件為：Cu靶／石墨單色器，電壓30 kV，電流20 mA，掃描速度0.1°·s－1，采樣時間1 s，掃描范圍5～50°。得X－射線衍射圖譜見圖5。對比圖a、b、c、d可見，納米粒圖譜中L100與SPD的特征吸收峰均消失，且有新的峰出現，表明L100與SPD之間發生了較強的相互作用，形成了無定形粉末，載藥納米粒藥物峰消失，提示藥物已被包裹其中。與FT－IR和DSC的分析結果一致。

圖5 X射線衍射圖

2.8 SPD－L100－55－NPs的體外釋放特性 采用動態透析法，取納米粒濃縮液2 mL，置于透析袋中，扎緊兩端，分別固定于40%乙醇pH 1.2鹽酸溶液和40%乙醇磷酸鹽緩沖溶液（pH 5.0、6.8、7.4、8.0）200 mL的釋放瓶中，置于（37±0.5）℃的恒溫振蕩器中，100 rpm振蕩。于不同時間點分別取樣2 mL，同時補加2 mL相應的同溫釋放介質。樣品經0.45μm微孔濾膜過濾，取續濾液20μL進樣，HPLC測定其中SPD的濃度，并計算其累積釋放百分率，繪制釋放曲線，結果見圖6。

圖6 SPD－L100－55－NPs的體外釋放曲線（n＝3）

從圖中可見：SPD－L100－55－NPs釋放呈現明顯的pH依賴性，藥物釋放率隨著pH值的升高而增大。10 h時在pH＜6.8的溶出介質中，藥物釋放率均＜30%；在pH 6.8介質中釋放34.8%；在pH＞6.8的介質中釋藥較快，在8 h藥物累積釋放都達到80%以上。

3 討論

改良－乳化溶劑擴散法適用于油脂溶性藥物和非水溶性載體材料制備納米粒，其原理為向水相中注入的有機相在乳化劑的作用下形成乳滴，在磁力攪拌作用下通過乳滴內部乙醇和外部水相之間的逆向擴散來包載藥物，在乙醇揮發的過程中形成納米粒子。本研究以水難溶性藥物SPD為模型藥物，非水溶性材料丙烯酸樹脂為載體，通過優化制備工藝和處方設計制備了平均粒徑65 nm的納米粒子，包封率高達99%。

體外釋放實驗結果表明，納米粒釋藥具有pH敏感性和緩釋特性。雖然L100－55在pH 5.5以上的介質中易于溶解，但實驗發現在pH 6.8時藥物釋放緩慢，這樣在體內可減少胃和小腸上段酶系對藥物的代謝作用，使SPD能夠在腸道最佳吸收部位達到較高濃度，提高其生物利用度。

［1］ 江紀武，肖慶祥.植物藥有效成分手冊［M］.北京：人民衛生出版社，1986：920－921. ［2］ 王家明，高慧敏，洪玉梅，等.預知子中α－常春藤皂苷的HPLC分析［J］.中國藥學雜志，2006，41（16）：1212－1214.

［3］ 時京珍，劉耕陶.黃褐毛忍冬皂甙對對乙酰氨基酚致小鼠肝臟毒性的保護作用［J］.藥學學報，1995，30（4）：311－314.

［4］ 時京珍，宛蕾，陳秀芬.黃褐毛忍冬總皂甙對幾種化學毒物致小鼠肝損傷的保護作用［J］.中藥藥理與臨床，1990，6（1）：33－34.

［5］ 劉亞平，劉杰，賈憲生，等.黃褐毛忍冬總皂甙對醋氨酚所致肝損傷的保護作用［J］.中國藥理學報，1992，13（3）：209－212.

［6］ 劉亞平，劉杰，賈憲生，等.黃褐毛忍冬總皂甙對鎘所致急性肝損傷的保護作用［J］.中國藥理學報，1992，13（3）：213－217.

［7］ Park HJ，Kwon SH，Lee JH，et al.Kalopanaxsaponin A is a basic saponin structure for the anti－tumor activity of hederagenin monodesmosides［J］.Planta Med，2001，67（2）：118－121.

［8］ 劉善奎，鐘延強，孫其榮，等.丙烯酸樹脂系列輔料在藥物新劑型中的應用［J］.藥學實踐雜志，2002，20（1）：12－15.

［9］ Dai JD，Wang XQ，Zhang T，etal.Preparation of cyclosporine A pH sensitive nanoparticles and oral pharmacokinetics in rats［J］.Yao Xue Xue Bao，2004，39（12）：1023－1027.

Preparation and in vitro evaluation of Saponins PD－Loaded Eudragit L100－55 Nanoparticles

LIYing1，2，YIN Hong-ran1，GENG Li-juan1，YOU Ben-gang1
（1.College of Pharmaceutical Science，Soochow University，Suzhou 215123，China；2.Suzhou Institute of Supervision and Inspection on Product Quality，Suzhou 215104，China）

ObjectiveTo prepare and in vitro evaluate Saponins PD loaded Eudragit L100－55 Nanoparticles（SPDL100－55－NPs）.MethodsThe SPD－L100－55－NPs were prepared bymodified quasiemulsion solvent diffusion technique.Taking particle size，entrapment efficiency and polydisperse index as comprehensive indexes，the orthogonal test design was used to optimize the preparation process.The characteristics of nanoparticles were determined by FT－IR，X－ray diffraction，DSC，etc.；In vitro releasewas investigated.ResultsNovel nanoparticleswere spherical，average particle size of nanoparticleswas（63.5±3.6）nm，EE 98.91%±0.18%，P.I.0.198±0.014.The release of SPD significantly depended on the pH conditions.ConclusionSPD－L100－55－NPs had high EE and homogeneous size distribution.The effect of drug sustained release of nanoparticleswas significant。

Saponins PD；Eudragit（L100－55）；Nanoparticles；Release

R944

A

2095－5375（2014）08－0464－006

國家自然科學基金青年基金（No.81102818）

李穎，女，研究方向：藥物分析，E－mail：ly0825ant＠163.com

游本剛，男，博士研究生，講師，研究方向：中藥新劑型與新技，Tel：13814809871，E－mail：youbengang＠suda.edu.cn