自發氣調對櫻桃番茄果實蛋白表達變化的影響

周 翔，姜 麗，宦 晨，安秀娟，郁志芳*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

自發氣調對櫻桃番茄果實蛋白表達變化的影響

周 翔，姜 麗，宦 晨，安秀娟，郁志芳*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

采用蛋白質組學方法研究自發氣調（modified atmosphere，MA）對櫻桃番茄果實保鮮的機理。經過雙向電泳和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜析，鑒定出39 個差異蛋白（P＜0.05），根據功能分為6 類：脅迫與防御蛋白（30.77%）、能量蛋白（25.64%）、細胞命運蛋白（15.38%）、成熟衰老蛋白（5.13%）、解毒蛋白（5.13%）和未分類蛋白（17.95%）；蛋白功能分析的結果顯示，MA增強了谷胱甘肽轉移酶、NADP-蘋果酸酶、真核轉錄起始因子5A-4和乙醇脫氫酶2的表達，抑制了水楊酸綁定蛋白2和1-氨基環丙烷-1-羧酸氧化酶的表達，表明MA能通過減緩乙烯合成速率以及提高櫻桃番茄果實的抗脅迫能力，從而延緩成熟衰老。

自發氣調；櫻桃番茄；蛋白質組學；延緩成熟衰老

櫻桃番茄（Solanum lycopersicum var. cerasiforme）又名迷你番茄、小番茄和圣女果等，富含番茄紅素和VC，但是果皮薄、不耐貯運，容易發生采后損失。為了延長采后番茄的貨架期，目前已經進行了多種處理對其保鮮的研究，包括自發氣調（modified atmosphere，MA）[1]、低溫[2]、和1-甲基環丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）[3]等。MA是通過果蔬的呼吸作用調節平衡密封環境中的氣體成分，延緩果蔬衰老的技術[4]。在對番茄進行MA的研究中，選取PVC塑料薄膜進行包裝，在3～4 d之后，氣體成分大約是3%～9% CO2和3%～9% O2，延緩了番茄的衰老[5]。但是MA保鮮存在一些問題，長時間的貯藏會導致腐爛率的上升[6]。

從生理生化和基因水平來闡釋MA影響果蔬成熟衰老的研究已經很多，對其機理已經有了初步的了解。MA降低了紫果西番蓮的乙烯合成、呼吸速率等代謝過程[6]。低氧也影響了番茄果實中多種基因的表達，包括熱激因子、熱激蛋白、發酵酶類、乙烯合成酶類等基因，其中熱激蛋白17.7（heat shock protein 17.7，HSP 17.7）和HSP 21基因被低氧誘導，可能對維持細胞穩態具有重要的作用[7]。Imahori等[8]發現3% O2處理會增強番茄果實中丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶和乳酸脫氫酶活性以及累積乙醛和乙醇。總體來說，MA會降低有氧呼吸和乙烯合成的速率，增強抗脅迫能力以延緩果蔬的成熟衰老，但同時會增加無氧呼吸酶的活性以及乙醛和乙醇的含量，對果蔬有一定的危害。目前，還沒有從蛋白質水平來研究MA對櫻桃番茄果實蛋白表達的影響。

最近十幾年，蛋白質組學逐漸成為一種研究果實發育和成熟的有效方法，包括高分辨率雙向電泳、凝膠染色、質譜鑒定和數據庫搜索。Rocco等[9]已經用蛋白質組學的方法比較了兩種番茄在成熟衰老過程中的蛋白表達差異，并且Faurobert等[10]研究了櫻桃番茄果皮蛋白在果實發育成熟過程中的變化。同時，盧丞文等[11]對番茄果實中蛋白質的提取和雙向電泳進行了優化。Zhang Li等[12]發現熱處理通過影響脅迫與防御、細胞結構、蛋白命運、能量代謝和成熟衰老蛋白來延緩桃子的成熟衰老。Shi等[13]用氮氣處理橘子24 h，然后用蛋白質組學方法進行研究，發現無氧環境誘導了糖酵解酶、熱激蛋白等蛋白的表達。因此，本實驗采用蛋白質組學的方法進行研究，初步闡釋MA影響櫻桃番茄果實蛋白表達的機理。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗中所研究的櫻桃番茄為紅熟期的“貴妃”，于2012年10月采摘自山東經預冷后運回實驗室。選擇果形整齊、大小均勻、無病蟲害、無機械損傷，且成熟度為紅熟期的果實作為研究材料，進行實驗處理。

1.2 方法

1.2.1 處理方法

MA處理：將櫻桃番茄隨機分成2 組，每組180 個果實，將挑選后的果實隨機分為3 份后再放置于經篩選獲得的聚氯乙烯包裝袋中，一組敞口，另一組封口，在低溫（8±1）℃條件下貯藏。初始氣體為大氣成分，貯藏期間氧氣體積分數逐步降低至第7天達到5%±1%，二氧化碳體積分數達到3%±1%，之后的貯藏期間氧氣與二氧化碳體積分數保持相對穩定。在貯藏期間每隔7 d進行取樣一份并且液氮冷凍，置于-20 ℃保存，以待進行雙向電泳實驗。重復3 次。

1.2.2 蛋白提取

根據Rocco[9]、Wang[14]等的方法略作修改。稱取5 g的果實凍樣，在研缽中充分研磨至粉末狀態。加入10 mL的SDS緩沖液（pH 7.5，包含100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷，30%蔗糖，2%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），5% β-巰基乙醇），然后加入等體積的平衡酚（pH 7.9），混勻靜置。在4 ℃、10 000 r/min的速率離心30 min。取上層酚相，加入4 倍體積的預冷乙酸銨-甲醇，劇烈搖晃，過夜沉淀蛋白。沉淀分別用預冷的甲醇和80%丙酮溶液清洗2 次，最后用預冷的純丙酮清洗1 次，4 ℃條件下干燥后溶于裂解緩沖液，-20 ℃保存備用。

蛋白質沉淀中加入400 μL裂解液（7 mmol/L尿素、2 mmol/L硫脲、4% CHAPS（3-[3-（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內鹽，3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]propanesulfonate）、1%二硫蘇糖醇、0.5%固相pH值梯度（immobilized pH gradient，IPG）緩沖液），4 ℃溶解過夜，用Bradford[15]方法定量蛋白質，按1 200 μg/gel的蛋白量進行上樣。

1.2.3 雙向電泳

第一向為等電聚焦實驗。通過水化上樣，將17 cm pH 5～8的IPG膠條浸泡在樣品溶液中，操作完畢后按照設定程序（表1）進行等電聚焦。然后將IPG膠條分別置于含2% DTT和2.5%碘乙酰胺的平衡液（包含6 mmol/L尿素、75 mmol/L三羥甲基氨基甲烷、pH 8.8、體積分數20%甘油、4 g/100mL 十二烷基硫酸鈉）中各平衡15 min，等待第二向垂直電泳。第二向為SDSPAGE。采用的膠濃度為12%，采用恒功率進行垂直電泳，先用1 W/gel跑1 h左右，改為15 W/gel進行電泳，直到溴酚藍到達膠底部，停止電泳，取下凝膠。染色前，用超純水清洗凝膠3 次，每次10 min。采用改進的考馬斯亮藍G-250膠體考染[16]，即用改進的膠體考染液（包含0.02% CBB G-250、5%硫酸鋁、10%乙醇和8%磷酸溶液）染色過夜，用蒸餾水沖洗凝膠一次，加入脫色液（10%乙醇和2%磷酸溶液）進行脫色，直到凝膠背景清晰，蛋白點明顯可見為止。

表1 17 cm線性膠條的雙向電泳等電聚焦程序Table 1 The isoelectric focusing programof 2-DE with 17 cm liner strips

1.2.4 凝膠的圖像采集與分析

脫色后的凝膠用Epson的2 400×4 800 dpi凝膠掃描儀采集圖像，保存為TIFF格式的圖像文件，并運用PDQuest 8.0.1軟件進行圖像分析。同一樣品的3 張膠組成一個重復組，選擇出重復性具有統計意義（t檢驗（P＜0.05））且具有2倍以上表達差異的蛋白點做質譜分析。

1.2.5 質譜分析和數據庫檢索

切取雙向電泳凝膠上的差異蛋白點，用超純水清洗后送至上海博苑生物科技公司進行膠內酶解和雙向電泳和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption-ionization time of fl ight mass spectrometry，MADLI-TOF-TOF-MS）分析，得到的結果是經過數據庫（NCBI）檢索的蛋白質信息。

1.3 數據處理

采用Origin 7.5和Excel軟件進行數據分析和作圖。

2 結果與分析

本實驗采用pH 5～8的IPG膠條進行等電聚焦，得到MA處理組和對照組的電泳圖譜，見圖1。PDQuest軟件分析可見，每張電泳圖譜上約有500 個蛋白點，且具有較好的重復性。經統計學分析，確定39 個具有2 倍及其以上差異的蛋白點（圖2）。對差異蛋白表達量的數據進行統計分析，發現MA處理對于櫻桃番茄果實蛋白的抑制作用大于增強作用（表2）。貯藏期間MA處理組較對照組有14 個蛋白的表達量得到了增強，25 個蛋白的表達得到了抑制，其中5 個蛋白點和9 個蛋白點在整個貯藏期間都表現出一致的增強和/或抑制作用。

圖1 櫻桃番茄果實的雙向電泳圖譜。Fig.1 Representative spot maps of cherry tomato fruits

經過質譜鑒定和數據庫搜索，差異蛋白共分為6 類，如圖3所示。比例最高的是脅迫防御和能量代謝，其次為細胞命運蛋白和成熟衰老蛋白，表明MA處理主要影響了櫻桃番茄果實成熟過程中脅迫與防御蛋白、能量蛋白、細胞命運蛋白和成熟衰老蛋白的表達，進而調節果實的成熟和衰老進程。

圖2 標有39 個差異蛋白點的櫻桃番茄果實雙向電泳圖譜Fig.2 Identification of 39 protein spots from cherry tomato fruits by 2-DE and MALDI-TOF-TOF-MS analysis

表2 櫻桃番茄果實對照組和MA處理組效果差異蛋白點數Table 2 Numbers of differentially expressed proteins from 2-DE maps in the control and MA treated cherry tomato fruits during storage

圖3 對照組和MA處理組貯藏不同時期差異蛋白的功能分類Fig.3 Functional classification of differentially expressed proteins identified from the control and MA-treated cherry tomato fruits with different storage periods

表3 對照組和MA處理組的櫻桃番茄果實貯藏不同時間后的差異蛋白鑒定表Table 3 Identification of proteins in MA-treated cherry tomato fruits stored for 0, 7, 14 and 21 days when compared with the control fruits at the corresponding storage periods

能量蛋白包括：ATP合酶（spot 5）、ATP酶（spot 38）、烯醇化酶（spot 14）、磷酸丙糖異構酶（spot 17）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（spot 22）、細胞質醛縮酶（spot 23）、細胞質烏頭酸合酶（spot 15）、NADP-蘋果酸酶（spot 39）、磷酸烯醇丙酮酸激酶（spot 21）和乙醇脫氫酶2（alcohol dehydrogenase 2，ADH 2，spot 28）。如表3所示，ATP合酶和ATP酶是參與ATP合成的酶，貯藏期間MA下調了這兩種蛋白質的表達量。烯醇化酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶參與了糖酵解途徑，在貯藏過程中被MA下調。在第7天，NADP-蘋果酸酶被MA處理誘導。作為乙醇發酵酶類，乙醇脫氫酶2被MA下調，說明MA處理抑制了糖酵解和ATP合酶的表達量，并且在一定程度上增強了乙醇發酵酶類的表達量。

脅迫與防御蛋白包括：ClpB1伴侶蛋白（spot 2）、小熱激蛋白（spot 13）、過氧化物酶-2F（spot 16）、L-抗壞血酸S（spot 19）、過氧化氫酶（spot 30和31）、溫度誘導膜脂蛋白（spot 6和spot 7）、類萌蛋白（spot 27）、Hop互作蛋白（spot 29）、谷胱甘肽轉移酶（glutathione S-transferase，GST，spot 32）和水楊酸綁定蛋白2（salicylic acid-binding protein 2，SABP 2，spot 33）。如表3所示，GST參與了谷胱甘肽的轉運過程，貯藏期間有增強表達的趨勢，且第7天被MA顯著上調。在貯藏過程中，MA處理組的SABP 2表達量相對于對照組有所下調。

細胞命運蛋白包括：真核轉錄起始因子5A-4（eukaryotic translation initiation factor 5A-4，eIF5A-4，spot 12）、絲氨酸蛋白酶前體（spot 26）、絲氨酸蛋白酶抑制劑（spot 4）、蛋白酶前體（spot 34）、依賴ATP的Clp水解蛋白酶3（spot 35）和蛋白酶（spot 37）。如表3，eIF5A-4是一種調控蛋白的啟動子，在14 d后被MA處理上調。成熟與衰老蛋白包括：1-氨基環丙烷-1-羧酸氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase，ACO，spot 1和spot 3）。如表3所示，這兩種蛋白的表達量在第14天的時候被MA顯著抑制。解毒蛋白包括：醛酮還原酶（spot 24）和乳酸谷胱甘肽酶（spot 25）。其余7個蛋白無法確定其具體功能，所以稱為未分類蛋白。

3 討論與結論

在生理生化水平上，MA能抑制紫果西番蓮的呼吸強度和乙烯合成[6]；在基因水平上，低氧能促進多種脅迫基因的表達[7]。在本研究中，MA對櫻桃番茄果實蛋白表達的影響主要集中在4個代謝中，即能量代謝、脅迫反應、細胞命運和乙烯代謝。

3.1 MA對能量蛋白的影響

MA處理產生的低氧和高二氧化碳氣體環境能抑制果蔬的呼吸強度[6]，對櫻桃番茄果實的能量代謝蛋白也產生了顯著影響，包括ATP相關酶類、糖酵解、三羧酸循環和乙醇發酵酶類。ATP 合酶（spot 5）和F1-ATP酶（spot 38）是氧化磷酸化的酶類，參與ATP合成反應。貯藏期間MA處理使這兩種酶表達量下調，抑制了ATP合成，降低了氧化磷酸化的強度。在本實驗中，3-磷酸甘油醛脫氫酶（spot 22）和烯醇化酶（spot 14）的表達受到MA處理的抑制，這與以柑橘材料的研究發現無氧會抑制3-磷酸甘油醛脫氫酶和烯醇化酶的表達結果相似[13]，說明MA處理會抑制糖酵解途徑。

NADP-蘋果酸酶（spot 39）催化蘋果酸生成丙酮酸和NADPH，參與檸檬酸穿梭系統。果實衰老過程中，利用NADP-蘋果酸酶產生的NADPH和丙酮酸來合成物質或產生能量，或者維持細胞內的pH值[17]。櫻桃番茄貯藏期間MA處理使NADP-蘋果酸酶表達量在第7天時上調，無氧也會促進柑橘材料中NADP-蘋果酸酶的上調，這種變化可能會提高櫻桃番茄果實抵抗脅迫的能力[13,18]。ADH參與了乙醇發酵反應，產生了乙醇。有研究發現低氧會誘導ADH基因的表達[7]，同時在蛋白水平上無氧也會誘導ADH的表達[13]，但在第7天和第14天，MA處理沒有誘導櫻桃番茄果實中ADH2（spot 28）的表達，可能是因為誘導了其他ADH同工酶。

3.2 MA對脅迫與防御蛋白的影響

GST（spot 32）催化谷胱甘肽共軛或谷胱甘肽過氧化物酶的活性，受高濃度的H2O2誘導[19]。通過GST對氧化脅迫激酶的調節作用，避免細胞遭受由H2O2介導的細胞死亡，說明GST參與了抗氧化反應[20]，降低了H2O2濃度。本實驗結果顯示，MA處理增強了GST的表達，尤其是第7天的促進作用最強，說明GST在櫻桃番茄果實的抗氧化過程中起到了重要的作用。據報道[21]，低氧也能增強梨體內谷胱甘肽還原酶等抗氧化酶的活性，從而增強其抗氧化能力。

GST家族成員很多，一些GST被鑒定為SABP，其活性被水楊酸抑制[22]。本實驗結果中，有一個關于水楊酸信號途徑的蛋白SABP 2（spot 33）被鑒定出來。水楊酸會提高H2O2濃度、膜脂過氧化和對蛋白產生氧化傷害[23]，而SABP 2沉默時會抑制水楊酸受體的活性[24]。MA處理抑制了SABP 2的表達，可能會弱化水楊酸對果實的作用，有利于延緩櫻桃番茄果實的成熟衰老。

3.3 MA對細胞命運蛋白的影響

eIF5A-4（spot 12）是一種與細胞死亡有關的啟動子元件，抵抗了細胞凋亡。在番茄果實中，eIF5A基因家族的4個成員都被表達，并且隨著果實的成熟衰老，eIF5A-4的轉錄水平會提高，提高植物的抗脅迫能力，延遲采后番茄的軟化和衰老[25]。貯藏第14天MA處理誘導了eIF5A-4的表達，增強了對細胞凋亡的抵抗作用，延緩了櫻桃番茄果實的成熟衰老。

3.4 MA對成熟衰老蛋白的影響

作為一種植物激素，乙烯對果實的成熟衰老具有重要的作用，而ACC氧化酶是乙烯生物合成中重要的酶。有研究表明，MA能抑制乙烯的合成速率[6]，同時低氧也會降低ACC氧化酶基因的表達[7]。在本實驗中，櫻桃番茄果實中的兩個ACC氧化酶被鑒定出來，包括spot 1和spot 3。在貯藏過程中，MA處理總體上抑制了這兩種蛋白的表達，影響了乙烯合成，從而影響櫻桃番茄果實的的成熟衰老，這與低氧或者無氧條件下乙烯合成會受到抑制的研究結果吻合[26]。

總的來說，貯藏期間MA對櫻桃番茄果實蛋白表達的影響主要包括：能量蛋白中增強了NADP-蘋果酸酶的表達，抑制了糖酵解相關酶的表達；脅迫與防御蛋白中增強了GST的表達，抑制了SABP 2的表達；細胞命運蛋白中，增強了eIF5A-4的表達，抑制了細胞凋亡；成熟衰老蛋白中抑制了ACC氧化酶的表達。通過以上蛋白的綜合作用，MA處理延緩了櫻桃番茄果實的成熟衰老。

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Proteomic Analysis of Cherry Tomato Fruits under Modified Atmosphere Conditions

ZHOU Xiang, JIANG Li, HUAN Chen, AN Xiu-juan, yU Zhi-fang*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095)

Proteomic analysis was used to understand the response mechanism of cherry tomato fruits during storage under modif i ed atmosphere (MA) conditions in this experiment. After two-dimensional electrophoresis and matrix-assisted laser desorption-ionization time of fl ight mass spectrometry (MALDI-TOF-TOF-MS), the results showed that there were 39 differently expressed spots (P ＜ 0.05), including 6 functional proteins, stress response and defense (30.77%), energy (25.64%), cell fate (15.38%), ripening and senescence (5.13%), detoxif i cation (5.13%) and others (17.95%). Among these proteins, glutathione S-transferase (GST), NADP-malic enzyme, eukaryotic translation initiation factor 5A-4 (eIF5A-4) and alcohol dehydrogenase 2(ADH 2) were increased by MA treatment, while salicylic acid-binding protein 2 (SABP 2) and 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidases (ACOs) were suppressed. This study indicated that the MA treatment of postharvest cherry tomato fruits could induce the stress response and suppress the ethylene metabolism to delay the ripening of cherry tomato fruits.

cherry tomato fruit; modif i ed atmosphere; proteomics; delaying ripening and senescence

TS255.3

A

1002-6630（2014）14-0234-06

10.7506/spkx1002-6630-201414045

2014-05-04

公益性行業（農業）科研專項（2014030232）

周翔（1990—），男，碩士研究生，主要從事采后果蔬蛋白質組學研究。E-mail：zhouxiang12390@126.com

*通信作者：郁志芳（1960—），男，教授，博士，主要從事采后生物學研究。E-mail：yuzhifang@njau.edu.cn