乙烯、1-MCP對毛竹春筍老化和ERS1基因表達的影響

陳惠云，孫志棟，吳峰華，楊虎清

（1.浙江省寧波市農業科學研究院農產品加工研究所,浙江寧波 315040；2.浙江農林大學農業與食品科學學院,浙江臨安 311300）

乙烯、1-MCP對毛竹春筍老化和ERS1基因表達的影響

陳惠云1，孫志棟1，吳峰華2，楊虎清2

（1.浙江省寧波市農業科學研究院農產品加工研究所,浙江寧波 315040；2.浙江農林大學農業與食品科學學院,浙江臨安 311300）

毛竹春筍采收后在20℃條件下用外源乙烯和1-MCP處理,研究乙烯和1-MCP對采后毛竹春筍木質化的調控作用。結果表明,乙烯處理提高了木質素合成相關的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂醇脫氫酶（CAD）和過氧化物酶（POD）的活性和ERS1基因的表達,促進組織中木質素和纖維素的積累,加快了毛竹春筍采后老化；1-MCP處理顯著降低了PAL、CAD和POD活性以及ERS1基因的表達水平,抑制了木質素和纖維素的積累,延緩了毛竹春筍采后木質化。推測毛竹春筍ERS1對乙烯信號是一種正調控模式,乙烯通過調控ERS1基因表達而影響毛竹春筍組織老化進程。

毛竹春筍；乙烯受體基因；cDNA克??；乙烯；1-MCP；木質化

1 材料與方法

1.1 材料與處理

毛竹（Phyllostachys pubescens Mazel）春筍采自浙江省余姚市馮村,采收當天選取筍長在35 cm,基徑在8 cm左右的春筍,隨機分成3組,每組60支。將毛竹春筍洗凈去殼,切除底部老蔸,用0.04%的NaClO溶液浸泡3 min,在通風處晾干。然后放入箱內放置有100 m L 1 mol的NaOH溶液200 L的密閉容器中,用不同藥劑進行處理。

試驗設3個處理：處理1空白對照（CK）,不用藥劑；處理2用1μL·L-11-MCP；處理3用500μL·L-1乙烯。處理溫度為20℃,處理時間均為8 h,重復3次。處理后置于恒溫20℃,相對濕度80%～85%,自然光的室內,任其自然老化。每隔24 h從基部向頂端15 cm處取樣。樣品用液氮冷凍,保存于-80℃的超低溫冰箱中,用于隨后的RNA提取和生理指標測定。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 乙烯釋放量

取3個毛竹春筍在20℃、5 L容器內密閉1 h,抽取1 m L氣樣用SP6800A氣相色譜儀（山東魯南瑞虹化工儀器有限公司）測定乙烯含量,重復3次。氣譜條件：氫焰離子化檢測器, GDX502填充柱,載氣、燃氣、助燃氣分別為N2、H2和空氣,柱溫100℃,檢測溫度100℃,進樣溫度120℃。

1.2.2 竹筍硬度

用TA-XT2 i型質構儀測毛竹春筍中部硬度,探頭直徑為5 mm,測試深度為6 mm,貫入速度為1 mm·s-1,取最大值,重復10次取平均值。

P21對HoxB4的調控機制及其影響造血干細胞增殖初步研究 … ……………… 李雪華，等(6):636

1.2.3 木質素和粗纖維含量

木質素和粗纖維含量測定分別參考鞠志國等［5-6］的方法并加以改進。

1.2.4 苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂醇脫氫酶（CAD）、過氧化物酶（POD）活性測定

稱取5.0 g竹筍樣品置于研缽中,加入10 m L 0.05 mol·L-1pH值7.8的磷酸緩沖液（含4% PVP,2 mmol·L-1EDTA和5 mmol·L-1巰基乙醇）,冰浴條件下研磨,將勻漿轉移至離心管中,于4℃、12 000 r·min-1離心20 min,收集上清液,即為酶液。PAL參照Zucker［7］的方法測定, CAD參照Mansell等［8］的方法測定,POD參考Kochba等［9］的方法測定。

1.3 ERS l基因表達

毛竹春筍總RNA提取采用TRIzol Kit及其說明書提供的方法。根據克隆的毛竹春筍乙烯受體基因ERS1和ACTIN序列,利用Primer 5.0設計PCR引物（ERS1：5′-GATGCTTACCCATGAAATCAGAAGCAC-3′和5′-CTGACAAACCTCTTGCAAATGGCAAG-3′；ACTIN：5′-GACAATGGCACTGGAATGGTCA-3′和5′-GCTCCTGCTCATAATCAAGGGC-3）,委托上海Sangon生物技術公司合成。RNA的反轉錄參照Fermentas公司的M2MLV反轉錄酶產品說明書進行。PCR反應根據Taq DNA聚合酶產品說明書進行。擴增程序為：95℃4 min；94℃45 s,54℃30 s,72℃1 min；72℃10 m in。35個循環。PCR產物用1.2%瓊脂糖/TAE電泳檢測。電泳條帶用Band leader 3.0圖像軟件分析,以目的基因與內參基因的電泳帶平均光密度的比值作為基因表達的相對數值,重復3次。

2 結果與分析

2.1 乙烯釋放量和硬度變化

如圖1中A所示,常溫下對照處理毛竹春筍的乙烯釋放量緩慢上升,采后2 d達到最大,然后逐漸下降；乙烯處理促進了毛竹春筍的乙烯釋放量,始終顯著高于對照和1-MCP處理的毛竹春筍；1-MCP處理抑制了毛竹春筍乙烯生成,在采后3 d內,其乙烯釋放量顯著低于對照和乙烯處理的毛竹春筍。圖1中B顯示,采后毛竹春筍的組織硬度均呈上升趨勢,乙烯處理毛竹春筍硬度快速上升且顯著高于對照,而1-MCP處理抑制了毛竹春筍硬度的增加。

2.2 纖維素和木質素含量

圖1 各處理春筍的乙烯釋放量和硬度變化

圖2 各處理春筍的木質素和纖維素含量變化

圖2 顯示,毛竹春筍采后20℃下的老化過程中,毛竹春筍木質素和纖維素含量均呈增加趨勢,乙烯和1-MCP處理毛竹春筍的變化趨勢與對照相似,但1-MCP處理顯著抑制了木質素和纖維素的合成,4 d后木質素和纖維素比對照減少12.1%和8.2%,而乙烯處理則促進了毛竹春筍木質素和纖維素的積累,分別比對照高8.3%和9.2%。

2.3 PAL、CAD和POD活性

毛竹春筍采后在20℃環境中組織的PAL活性呈現峰型變化,貯藏前期PAL活性迅速上升,于采后3 d達到高峰,之后趨于下降（圖3中A）；而CAD和POD活性是持續上升的,但后2 d上升趨于緩慢（圖3中B和C）。乙烯處理提高了PAL、CAD和POD活性,始終高于對照水平,而1-MCP處理均有效地抑制APL、CAD和POD的活性。

2.4 ERS l基因的表達

如圖4所示,毛竹春筍經外源乙烯處理后,與對照相比,能夠顯著促進組織中ERS1基因的表達,加速毛竹春筍木質化,而1-MCP處理則明顯抑制ERS1基因的表達,從而延緩了毛竹春筍組織的老化。

圖3 各處理春筍的PAL、CAD和POD活性變化

圖4 各處理春筍的ERS1表達變化

3 小結與討論

竹筍采后易木質化。植物木質化作用是木質素單體經聚合反應形成木質素大分子沉積在細胞壁的過程,組織木質化是細胞次生壁形成的主要特征之一,木質素單體合成則是木質化作用的中心［10］。提高PAL、CAD或POD酶活性可顯著增加植物組織木質素含量［11］。通過反義RNA技術抑制這些酶的活性,均能夠改變木質素的含量和構成［12］。本試驗中,采用乙烯處理促進毛竹春筍的乙烯釋放,提高了PAL、CAD和POD活性,顯著增加了毛竹春筍組織中木質素和纖維素的積累,加速了毛竹春筍老化。而1-MCP處理則降低了采后毛竹春筍的乙烯釋放速率,抑制了PAL、CAD和POD活性以及木質素和纖維素的合成,延緩了老化,這和羅自生等［3］的研究結果一致。

乙烯調控毛竹春筍老化與受體基因表達有關。在乙烯信號傳導過程中,植物激素乙烯只有與受體結合,通過一系列的信號傳導,才能誘導植物衰老反應［13］。在擬南芥中乙烯的感受包括5個與膜結合的乙烯受體基因（ETR1、ERS1、ETR2、ERS2和EIN4）,并且乙烯受體是乙烯反應的負調控因子［14］。從番茄果實中已分離出6個乙烯受體基因［15］。本試驗克隆了毛竹春筍乙烯受體基因ERS1,并分析了ERS1對乙烯和1-MCP處理的相應表達水平,發現ERS1對乙烯信號表達上調,對1-MCP表達下降,因此,推測毛竹春筍ERS1對乙烯信號是一種正調控模式,賀立紅等［16］也報道香蕉ERS1對乙烯是正調控。乙烯和1-MCP通過調控ERS1基因表達而影響毛竹春筍組織老化進程。

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（責任編輯：張才德）

S 644.2

A

0528-9017（2014）03-0336-03

文獻著錄格式：陳惠云,孫志棟,吳峰華,等.乙烯、1-MCP對毛竹春筍老化和ERS1基因表達的影響［J］.浙江農業科學,2014（3）：336-338,343.

2013-12-19

寧波市自然科學基金項目（2012A610134）；寧波市農業重大（重點）擇優委托科技攻關項目（2012C10018）

陳惠云（1980-）,女,浙江余姚人,農藝師,主要從事農產品貯藏與加工研究工作。E-mail：chhyun@163.com。

楊虎清。E-mail：yanghuqing@sohu.com。