酶輔助法提取藕節中總黃酮及·OH清除活性研究

李會端，李云興

（楚雄師范學院,云南楚雄 675000）

酶輔助法提取藕節中總黃酮及·OH清除活性研究

李會端，李云興

（楚雄師范學院,云南楚雄 675000）

優選藕節中總黃酮的提取工藝條件,并研究其對羥自由基（·OH）的清除活性。采用纖維素酶輔助法提取藕節中的總黃酮,以70%乙醇固定提取,固定料液比為1∶20 g·m L-1和回流時間為1 h。設計單因素試驗初步探究了酶濃度、酶解溫度、酸堿度、酶解時間4個單因素條件對總黃酮提取率的影響,設計L9（34）正交試驗確定了藕節中總黃酮提取的較佳試驗條件。結果顯示,酶濃度0.20 mg·m L-1,酶解溫度55℃,pH為5.0,酶解時間2.5 h為藕節中的總黃酮提取的較佳條件,藕節中總黃酮提取率為2.680%。探究了藕節黃酮提取液對·OH的清除活性,與BHT的抗氧化劑活性對照,藕節總黃酮提取液對·OH有較強的清除活性。

酶輔助法；藕節；總黃酮；提取率；單因素試驗；正交試驗；清除活性

黃酮類化合物泛指2個苯環中間通過3個碳原子連接形成的一系列化合物。黃酮類化合物具有抗氧化、抗癌、消炎、殺菌、抗病毒和調節肌體免疫力等功效［1-3］。黃酮類化合物的提取方法有傳統浸提法、超聲波提取法、微波提取法、超臨界流體萃取法及酶解法［4］。由于植物細胞壁的束縛作用,使得總黃酮在提取過程中不易溶出。纖維素酶能降解植物細胞壁的纖維素骨架,增加細胞內活性成分的溶出,進而釋放出黃酮。纖維素酶輔助法提取植物中的總黃酮,具有操作簡單、提出率高等特點。酶解法提取山楂中總黃酮,提取率高達（2.67± 0.06）%［5］。蓮藕屬睡蓮科植物,在我國有悠久的栽培歷史。藕節為藕的干燥根莖節部。藕有較高的食用營養價值,但藕節因不能進食往往容易被人們所忽視［6-8］。余美料等［9］采用純物理的工藝流程提取蓮藕中黃酮類物質,利用紫外線分光光度法測得樣品中總黃酮的含量為1.13%。作者擬采用纖維素酶酶解法提取藕節中總黃酮,通過單因素和正交試驗,探究藕節中總黃酮提取工藝的較佳試驗條件,旨在為從藕節中黃酮類化合物的提取和開發利用提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

干藕節（楚雄同濟堂一中店,產地昆明）粉碎,備用。無水乙醇；纖維素（＞30 U·mg-1）；蘆丁標準品、二丁基羥基甲苯、水楊酸、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵、雙氧水、氯化鋁（分析純）；三氯化鐵；鋅粉；亞硝酸鈉；硝酸鋁；氫氧化鈉等。

722型光柵分光光度計（山東高密彩虹分析儀器有限公司）,CP214c電子天平,HH-S2s恒溫水浴箱,J1050型托盤天平,DFY-500 500 g搖擺式高速中藥粉碎機,電熱鼓風恒溫干燥箱,回流裝置,蒸餾裝置,容量瓶,吸量管等。

1.2 試驗方法

1.2.1 總黃酮提取率的計算方法

以蘆丁標準品為對照,測定藕節中總黃酮的提取率,藕節總黃酮提取液的顯色反應參考文獻［10］。分光光度計測量吸光度（D）值,與總黃酮濃度服從Lambert-Beer定律。將藕節提取液的吸光值代入線性回歸方程,計算提取液中總黃酮濃度,計算藕節中總黃酮提取率。

C0=C×V÷V0,χ/%=100C0÷（2.000× 1 000）×100。

式中,χ藕節中總黃酮的含量,C為稀釋后濃度,C0為原提取液濃度。

1.2.2 總黃酮提取液對羥自由基的清除活性

參照Fenton反應體系。若向該體系中加入藕節提取液,與水楊酸競爭·OH,導致有色絡合物生成量減少。固定反應時間,在510 nm處測量藕節提取液的D值,與空白液對照,測定藕節中總黃酮對·OH的清除率。清除率計算公式：

·OH的清除率/%=（D0-Dx+Dx0）÷ D0×100。

式中,D0為空白對照溶液吸光度,Dx為提取液吸光度,Dx0為不加H2O2提取液的本底吸光度。

1.3 蘆丁標準曲線繪制與線性關系考察

準確稱取干燥的蘆丁樣品0.010 0 g,用70%乙醇充分溶解,轉移至50 m L容量瓶中用同樣濃度的乙醇稀釋定容至刻度,搖勻,備用。移取0.5 m L蘆丁標準液于50 m L容量瓶中,蘆丁標準液的顯色反應參考文獻,以試劑空白做參比,在460～540 nm之間測量D值,確定最大吸收峰波長。

分別移取蘆丁標準液0.00,0.50,1.50,2.50, 3.50,4.50,5.50,6.50 mL于50.00 mL容量瓶中,在最大波長處測定D值,繪制標準曲線。

1.4 提取液的定性試驗

稱取2.000 0 g樣品置于50 m L圓底燒瓶中,加入40 m L 70%乙醇,水浴回流提取1 h。即得總黃酮提取液。

分別移取1.00 m L藕節總黃酮提取液和蘆丁標準液于小試管中,第1組試管加入少許鋅粉,再滴加幾滴濃鹽酸,振蕩,必要時微熱,觀察試驗現象。第2組試管滴加幾滴硝酸鋁溶液,振蕩,觀察試驗現象。第3組試管滴加幾滴三氯化鐵溶液,振蕩,觀察試驗現象。

1.5 單因素試驗

分別準確稱取2.000 0 g藕節粉于6支50 m L圓底燒瓶中,單因素處理后,再分別加入28 m L乙醇回流提取1 h,抽濾,洗滌,合并濾液和洗滌液轉入50 mL容量瓶,用乙醇定容。

1.5.1 纖維素酶濃度對總黃酮提取率的影響

向6支圓底燒瓶中分別加入12 m L纖維素酶濃度為0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30 mg· m L-1的70%的乙醇,調節pH值為5.00,在50℃恒溫水浴中酶解1.5 h。

1.5.2 酶解溫度對總黃酮提取率的影響

向6支圓底燒瓶中各加入12 m L纖維素酶濃度為0.15 mg·mL-1的70%的乙醇,調節pH值為5.00,分別在40℃,45℃,50℃,55℃,60℃, 65℃恒溫水浴中酶解1.5 h。

式(20)～式(22)中，th的認領時間TExch介于其自身的開始時間TBh與操作oph的開始時間之間，且th的結束時間TEh與下一個任務節點th+1的開始時間TBh+1及操作oph的結束時間相等，即滿足

1.5.3 酶解pH對總黃酮提取率的影響

向6支圓底燒瓶中各加入12 m L纖維素酶濃度為0.15 mg·mL-1的70%的乙醇,分別調節pH值為3.50,4.00,4.50,5.00,5.50,6.50,在50℃恒溫水浴中酶解1.5 h。

1.5.4 酶解時間對總黃酮提取率的影響

向6支圓底燒瓶中各加入12 m L纖維素酶濃度為0.15 mg·m L-1的70%乙醇,調節pH值為5.00,在50℃恒溫水浴中分別酶解0.5,1.0, 1.5,2.0,2.5,3.0 h。

1.6 正交試驗

根據酶濃度（A）、酶解溫度（B）、酶解pH值（C）和酶解時間（D）等單因素試驗所確定的范圍,以藕節中黃酮含量為研究對象設計正交試驗,采用L9（34）的正交表來確定最優方案。1-3水平：A為0.20,0.25和0.30 mg·m L-1；B為50℃,55℃和60℃；C為4.5,5.0和5.5；D為1.5,2.0和2.5 h。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線與線性關系方程

圖1 蘆丁標準溶液的吸收光譜

2.2 總黃酮提取液定性

表1表明,顯色反應現象與黃酮類化合物顯色反應現象相同,表明藕節中含有黃酮類化合物［10］。

表1 藕節總黃酮提取液的顯色反應

2.3 單因素對總黃酮提取率的影響

2.3.1 酶濃度

圖2表明,隨著纖維素酶濃度增加,總黃酮提取率明顯提高,當酶濃度為0.20 mg·m L-1時,黃酮提取率達到最大,此后增加纖維素酶濃度,總黃酮提取率開始下降。試驗結果表明,藕節總黃酮提取的較佳酶濃度為0.20 mg·m L-1。酶濃度為0.20 mg·m L-1時酶解效率最大,再增加酶濃度,酶解效率趨于平衡。

圖2 酶濃度對總黃酮提取率的影響

2.3.2 溫度

圖3表明,在40～55℃,隨著酶解溫度升高總黃酮提取率顯著增加,酶解溫度達55℃時,總黃酮提取率最大,此后隨著酶解溫度升高,總黃酮提取率迅速降低。分析原因,隨著酶解溫度升高,酶部分失去活性,溫度升高導致先溶出的黃酮類化合物部分分解,總黃酮提取率降低。

圖3 酶解溫度對總黃酮提取率的影響

2.3.3 pH值圖4表明,隨pH值增大,藕節總黃酮提取率明顯增加,當pH為5.0時,總黃酮提取率最大,繼續增加pH,總黃酮提取率開始降低。分析原因,酶在特定酸堿度下,酶解活性最大,過酸或過堿都會使得酶的活性降低,甚至喪失。藕節總黃酮提取試驗中纖維素酶的最佳活性pH值為5.0。

圖4 酶解pH值對總黃酮提取率的影響

2.3.4 酶解時間對總黃酮提取率的影響

圖5表明,隨著酶解時間延長,總黃酮提取率顯著增加,酶解時間為2.5 h時,總黃酮提取率最高,再延長酶解時間,總黃酮提取率開始降低。分析原因為時間太短,酶解不充分,總黃酮提取不完全；時間過長,部分黃酮類化合物會分解,導致總黃酮提取率降低。

圖5 酶解時間對總黃酮提取率的影響

2.4 多因素對總黃酮提取率的影響

表2表明,用70%乙醇溶液作提取溶劑,酶濃度0.20 mg·mL-1,酶解溫度55℃,酶解pH值為5.0,酶解時間為2.0 h,即A1B2C2D2為最佳提取條件。A極差最小,即酶濃度對藕節總黃酮提取率影響最小；B極差最大,即酶解溫度對藕節總黃酮提取率影響最大。正交試驗確定的各因素對纖維素酶輔助法提取藕節總黃酮的影響程度依次為B＞D＞C＞A。

按照上述最佳提取條件進行驗證性試驗,進行3組平行試驗,纖維素酶輔助法提取藕節中總黃酮平均提取率為2.68%。

表2 正交試驗結果

2.5 藕節總黃酮提取液對·OH清除活性研究

按照1.1.2操作,參考Fenton體系,加入不同體積藕節提取液,在510 nm處測D,扣除提取液本底吸收［10］。進行3組平行試驗,代入公式計算藕節總黃酮提取液對·OH清除率。以BHT對照,比較2種抗氧化劑對·OH的清除活性（圖6）。藕節總黃酮提取液對·OH有清除活性,且隨著提取液體積增加,清除率逐漸增加。試驗結果顯示藕節總黃酮提取液對· OH清除活性要高于相同體積的BHT。

圖6 總黃酮提取液和BHT對·OH清除活性比較

3 小結和討論

通過采用纖維素酶輔助法提取藕節中總黃酮, 70%乙為醇固定提取劑,料液比為1∶20 g·m L-1和回流時間為1 h,考查纖維素酶濃度、酶解溫度、酶解pH值及酶解時間4個單因素對藕節總黃酮提取率的影響,設計正交試驗確定了藕節總黃酮提取的較佳條件為：纖維素酶濃度為0.20 mg·m L-1,酶解溫度55℃,pH值為5.0,酶解時間為2.0 h,測得藕節總黃酮提取率為2.68%。較文獻報道的蓮藕果實中總黃酮提取率1.30%要高出2倍,可見蓮藕不同部位總黃酮含量差異較大。纖維素酶輔助法提取藕節總黃酮的方法酶用量少,操作簡便,提取率高。與70%乙醇回流提取法相比,總黃酮提取率有顯著增加。初步探究了藕節總黃酮提取液對·OH清除活性。對照試驗結果顯示,藕節總黃酮提取液對·OH的清除活性高于相同濃度的BHT。

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（責任編輯：張瑞麟）

TS 201.2

A

0528-9017（2014）03-0383-04

文獻著錄格式：李會端,李云興.酶輔助法提取藕節中總黃酮及·OH清除活性研究［J］.浙江農業科學,2014（3）：383-386.

2013-11-01

云南省應用基礎研究項目（2012FD050）；楚雄師范學院科學研究基金項目（11YJGG01）

李會端（1983-）,女,講師,博士,研究方向為天然食品化學成分分析及應用研究。E-mail：lhd08@cxtc.edu.cn。