殼聚糖固定化茶皂素脫色酶及其酶學(xué)性質(zhì)的研究

李艷麗，陳列忠，陶瑛妮

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所,浙江杭州 310021；2.浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,浙江杭州 310021；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué),浙江杭州 310053）

殼聚糖固定化茶皂素脫色酶及其酶學(xué)性質(zhì)的研究

李艷麗1，2，陳列忠1，2，陶瑛妮3

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所,浙江杭州 310021；2.浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,浙江杭州 310021；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué),浙江杭州 310053）

以殼聚糖微球?yàn)檩d體,戊二醛為交聯(lián)劑,對(duì)茶皂素脫色酶進(jìn)行固定化,并對(duì)固定化酶的各種性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,0.5 g殼聚糖微球在5 m L 2.0%的戊二醛溶液中交聯(lián),固定5 mg茶皂素脫色酶,最終獲得的酶活回收率為65.94%。固定化酶的最適溫度為50℃,最適pH值為3.5,固定化酶的熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性以及保存穩(wěn)定性都明顯優(yōu)于游離酶,該固定化酶還具有良好的操作性。

殼聚糖；固定化；茶皂素脫色酶

茶皂素作為一種從山茶科植物種子中提取的化合物,具有優(yōu)良的乳化、分散、濕潤(rùn)、起泡、穩(wěn)泡等作用,用途廣泛,但產(chǎn)品色澤深、含量低卻是限制其開(kāi)發(fā)利用的主要質(zhì)量原因。本研究室已從黃孢原毛平革菌發(fā)酵液中分離到了一種可以脫色茶皂素的生物酶,但由于自由酶本身具有不可重復(fù)使用、容易變性失活等［1］特性,限制了其實(shí)際應(yīng)用。酶固定化技術(shù)是實(shí)現(xiàn)酶重復(fù)連續(xù)使用的有效手段。

殼聚糖分子中含有游離氨基,雙功能試劑如戊二醛等與殼聚糖及蛋白酶上的氨基均能發(fā)生Schiff反應(yīng),因此可用其來(lái)作為固定化酶的載體。殼聚糖作為固定化酶載體還具有機(jī)械性能好,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,耐熱性好以及使酶免受金屬離子抑制等優(yōu)點(diǎn),成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究最熱門(mén)的固定化材料之一［2-5］。本試驗(yàn)采用殼聚糖固定茶皂素脫色酶,探討了固定化酶脫色茶皂素的影響因素。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

茶皂素脫色酶由本實(shí)驗(yàn)室分離純化,活力單位52 971 U·g-1；25%戊二醛（上海化學(xué)試劑站分裝產(chǎn)品）為分析純；98%4-氨基安替比林和殼聚糖（脫乙酰度90%）為化學(xué)純（阿拉丁）；試驗(yàn)中所用其余常用試劑均為分析純,市售產(chǎn)品。

1.2 茶皂素脫色酶的固定

殼聚糖微球的制備參考文獻(xiàn)［6］。

茶皂素脫色酶的固定。稱取適量殼聚糖微球,加入一定濃度的戊二醛,在室溫下攪拌,靜置過(guò)夜,離心去上清液,將載體用蒸餾水沖洗以除去殘余的戊二醛,抽濾。往交聯(lián)好的殼聚糖微球中加入茶皂素脫色酶液,在室溫下緩慢攪拌,靜置過(guò)夜。離心棄去上清液,沉淀用蒸餾水反復(fù)沖洗,抽濾即得固定化酶。

1.3 酶活測(cè)定

脫色酶的活力定義為每毫升酶液（或每克酶粉）1 h內(nèi)將茶皂素底物緩沖液在475 nm條件下D值降低1%為一個(gè)酶活單位U。

底物緩沖液的配置。以茶皂素做為底物,用pH值5.0的0.1 mol·L-1醋酸緩沖液溶解,配制成的溶液在475 nm分光光度計(jì)下測(cè)定D值為3.5。

自由茶皂素脫色酶活性測(cè)定。取0.5 m L酶液,加入3.5 mL的底物緩沖液,混合均勻后置于40℃水浴中保溫1 h,475 nm分光光度計(jì)下測(cè)定D,并計(jì)算其降低百分比。固定化茶皂素脫色酶活性測(cè)定反應(yīng)體系同自由漆酶,取適量固定化茶皂素脫色酶與底物混合,在30℃攪拌反應(yīng)1 h,離心取上清液,于波長(zhǎng)475 nm處測(cè)D值。固定化茶皂素脫色酶的酶活用每克載體具有的酶活單位（U·g-1）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶皂素脫色酶的固定

2.1.1 戊二醛濃度對(duì)酶固定化的影響

戊二醛是一種雙官能團(tuán)試劑,可與載體上的氨基進(jìn)行schiff反應(yīng),再與酶發(fā)生schiff反應(yīng)。稱取殼聚糖微球0.5 g,分別加入不同濃度的戊二醛溶液（0.5%～3%）5 m L,按1.2節(jié)方法得到固定化酶,分別測(cè)各固定化酶的活力（圖1）。固定化酶的活力隨戊二醛濃度的增加而增大,當(dāng)戊二醛濃度達(dá)到2%時(shí),其活力達(dá)到最大,此后戊二醛濃度繼續(xù)增加,而固定化酶的活力降低,說(shuō)明酶分子活性基團(tuán)被戊二醛過(guò)多地修飾導(dǎo)致了酶活力的下降。

圖1 戊二醛濃度對(duì)酶固定化的影響

2.1.2 加酶量對(duì)酶固定化的影響

取0.5 g殼聚糖微球與2%戊二醛的交聯(lián)物,分別加入不同量的茶皂素脫色酶酶液,使之固定化,分別測(cè)定固定化酶活力（圖2）。在殼聚糖結(jié)合位點(diǎn)未飽和前,固定化酶活力隨著加酶量的增加而升高；但當(dāng)加酶量超過(guò)5 mg后,固定化酶的活力不再增加,說(shuō)明5 mg酶量已讓結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和狀態(tài),繼續(xù)增加酶量不能增加固定化酶的相對(duì)活力。

圖2 加酶量對(duì)酶固定化的影響

在試驗(yàn)條件下,0.5 g殼聚糖微球在5 m L 2.0%的戊二醛溶液中交聯(lián)過(guò)夜后,加入5 mg酶量的溶液,在室溫下吸附反應(yīng)過(guò)夜,最終獲得的酶活回收率為65.94%。

2.2 固定化酶的性質(zhì)

2.2.1 溫度對(duì)固定化酶活力的影響

按照茶皂素脫色酶反應(yīng)體系,分別于不同溫度下測(cè)定固定化酶的活力（圖3）。游離酶的最適溫度為40℃,且在30～40℃溫度內(nèi)保持較高的酶活；固定化酶的最適溫度為50℃,且在40℃～60℃內(nèi)都保持了較高的酶活力。這說(shuō)明固定酶不但比游離酶最適反應(yīng)溫度有所提升,還擴(kuò)大了溫度反應(yīng)范圍,對(duì)溫度的敏感性有所下降。

圖3 溫度對(duì)自由酶和固定化酶活力的影響

2.2.2 pH值對(duì)固定化酶活力的影響

按照茶皂素脫色酶反應(yīng)體系,分別于不同pH值下測(cè)定固定化酶的活力（圖4）。游離酶的最適pH值為4.5,固定化酶的最適pH值為3.5,相對(duì)于游離酶,固定化酶的最適pH向酸性發(fā)生了偏移。

圖4 pH值對(duì)自由酶和固定化酶活力的影響

2.2.3 固定化酶的熱穩(wěn)定性

取一定量的固定化酶和游離酶,分別加入pH值4.0的緩沖液,在不同溫度下處理30 m in,測(cè)定其酶活（圖5）。酶經(jīng)固定化后熱穩(wěn)定性較游離酶顯著提高。這可能是酶與載體的結(jié)合影響了酶的穩(wěn)定性,酶經(jīng)載體吸附和戊二醛交聯(lián)后,增加酶構(gòu)型的牢固程度,同時(shí)酶蛋白在固定化后,限制了酶分子之間的相互作用,阻止了酶的自溶,從而明顯增加了酶的熱穩(wěn)定性。

圖5 自由酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性

2.2.4 固定化酶的操作穩(wěn)定性

游離酶無(wú)法從反應(yīng)體系中分離,因此不能重復(fù)利用。而固定化酶則可從反應(yīng)體系中分離并重復(fù)使用。將0.5 g固定化酶與茶皂素溶液在50℃下連續(xù)反應(yīng)6次,每次反應(yīng)時(shí)間為1 h,反應(yīng)后分別測(cè)定酶活力（圖6）。固定化酶的活力基本保持穩(wěn)定,活力損失小于20%,由此可見(jiàn),該固定化酶具有良好的操作穩(wěn)定性。

圖6 固定化酶的操作穩(wěn)定性

2.2.5 固定化酶的保存穩(wěn)定性

將自由酶和固定化酶在4℃下存放2周,每2 d測(cè)定其酶活力（圖7）。固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性較好,2周后約有90%的相對(duì)酶活,而自由酶僅為74%,由此可見(jiàn),固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性大大提高。

圖7 自由酶和固定化酶的保存穩(wěn)定性

3 小結(jié)

以殼聚糖微球?yàn)檩d體,戊二醛為交聯(lián)劑,固定茶皂素脫色酶的最佳條件為：0.5 g殼聚糖微球在5 m L 2.0%的戊二醛溶液中交聯(lián)過(guò)夜后,加入5 mg酶量的溶液,在室溫下吸附反應(yīng)過(guò)夜,最終獲得的酶活回收率為65.94%。

固定化酶的最適溫度為50℃,最適pH值為3.5,且其熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性以及保存穩(wěn)定性都明顯優(yōu)于游離酶,同時(shí)還具有良好的操作性。

［1］ Durán N,Rosa M A,D，Annibale,et al.Applications of laccases and tyrosinases（phenoloxidases）immobilized on different supports：a review［J］.Enzyme and M icrobial Technology,2002,31：926-927.

［2］ 莫旖,姬琳,柳暢先.固定化脲酶的制備及應(yīng)用［J］.分析科學(xué)學(xué)報(bào),2013,29（1）：85-88.

［3］ 王周利,岳田利,袁亞宏,等.脂環(huán)酸芽孢桿菌α-葡萄糖苷酶固定化及酶學(xué)性質(zhì)研究［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào),2013, 13（2）：67-72.

［4］ 周濤,朱雄軍,蘇建華,等.葡萄糖氧化酶的有機(jī)相共價(jià)固定化［J］.生物工程學(xué)報(bào),2012,28（4）：476-487.

［5］ 李璟,王燕,楊山虎,等.固定化微生物脂肪酶粉轉(zhuǎn)化生物柴油研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,24（3）：494-498.

［6］ 羅華麗,魯在君.殼聚糖微球制備工藝優(yōu)化與分析［J］.周口師范學(xué)院學(xué)報(bào),2007,24（2）：63-66.

（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S 182

A

0528-9017（2014）03-0387-03

文獻(xiàn)著錄格式：李艷麗,陳列忠,陶瑛妮.殼聚糖固定化茶皂素脫色酶及其酶學(xué)性質(zhì)的研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014（3）：387-389.

2013-11-19

杭州市農(nóng)業(yè)科研攻關(guān)項(xiàng)目（20120232B61）；杭州市科技發(fā)展項(xiàng)目（20110232B11）

李艷麗（1980-）,女,山東威海人,助理研究員,從事微生物學(xué)研究工作。E-mail：89746744@qq.com。

陳列忠。E-mail：zwsclz@163.com。