LAMP技術及其在轉基因檢測中應用研究進展

陳 曦，張明哲，吳志毅，林曉佳，陳吳健，夏 拯

（浙江省檢驗檢疫科學技術研究院,浙江杭州 310016）

LAMP技術及其在轉基因檢測中應用研究進展

陳 曦，張明哲，吳志毅，林曉佳，陳吳健，夏 拯

（浙江省檢驗檢疫科學技術研究院,浙江杭州 310016）

LAMP技術由于其檢測靈敏度高、檢測特異性強、操作簡單、快速高效等優點,已在轉基因檢測領域中得到廣泛應用。本文簡要綜述該技術的原理、發展過程及其在轉基因領域中應用研究的進展。

LAMP；轉基因檢測；進展；應用

近年來,轉基因作物發展速度迅猛,至2012年全球轉基因作物種植面積達到1.703億hm2,比2011年的1.6億hm2增長6%,即1 030萬hm2。而在中國同樣種植了約400萬hm2的轉基因棉花。隨著轉基因作物種植面積的增加,對于轉基因產品的爭議也越來越大。一方面,中國農業部在2009年審放了轉基因耐除草劑水稻Bt汕優63等3個轉基因農作物的生產應用安全證書；在2013年審放了抗除草劑大豆CV127等3個品系的轉基因大豆進口用作加工原料的農業轉基因生物安全證書。另一方面,近年中國出口的米制品屢遭歐盟通報；2008,2011年先后2次對中國出口米制品發布決議,對其抽查范圍、檢測力度都有加強。如何快速準確地檢測轉基因產品,成為了目前熱門的課題之一。

2000年由Notom i等［1］發明的環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一種新的恒溫核酸擴增方法,相較于傳統的核酸擴增方法,具有檢測靈敏度高、檢測特異性強、操作簡單、快速高效的優點,因此越來越多被應用于轉基因檢測中。

l LAMP技術的原理

1AMP技術在可使核酸擴增的65℃恒溫條件下進行,其擴增效率可達10億～100億個拷貝數量級。其主要原理是通過采用特異地識別靶序列上6個區域的4條引物（2條內引物-FIP/BIP,2條外引物-F3/B3）及具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶,將擴增反應步驟分為2個部分進行啞鈴狀模板構造的形成與循環擴增［2］。如圖1所示,65℃左右時,FIP引物在Bst酶作用下以F2區段的3′末端為起點,與模板DNA互補序列配對,啟動鏈置換DNA合成（1～2）。F3引物與F2c前端F3c序列互補,以3′末端為起點,通過鏈置換型DNA聚合酶的作用,一邊置換先頭FIP引物合成的DNA鏈,一邊合成自身DNA,如此向前延伸（3）。最終F3引物合成而得的DNA鏈與模板DNA形成雙鏈（4）。由FIP引物先合成的DNA鏈被F3引物進行鏈置換產生一單鏈,這條單鏈在5′末端存在互補的F1c和F1區段,于是發生自我堿基配對,形成單邊環狀結構（5）。同時這條單鏈DNA,又可作為模板,在另一端結合BIP引物和B3引物合成一條雙鏈,并置換出一條單鏈DNA（6～7）。此時,被置換的單鏈DNA兩端都存在互補序列,自我堿基配對后整條鏈呈現啞鈴狀構造（8）。

圖1 啞鈴狀模板構造的形成過程

如圖2所示,上述過程中最后形成的啞鈴狀模板構造是循環反應的原料。在循環反應中,首先在啞鈴狀結構中,以3′末端的F1區段為起點,以自身為模板,進行DNA合成延伸。與此同時,FIP引物F2與環上單鏈F2c雜交,啟動新一輪鏈置換反應。解離由F1區段合成的雙鏈核酸。同樣,在解離出的單鏈核酸上也會形成環狀結構。在環狀結構上存在單鏈形式B2c,BIP引物上的B2與其雜交,啟動新一輪擴增。最終形成如花椰菜樣的莖-環結構DNA組成的混合物,即由在同一條鏈上互補序列周而復始形成大小不一的結構。整個反應僅需1 h,具有簡便、快速、準確等特點。

圖2 LAMP反應擴增循環過程

2 LAM P技術的發展

1AMP技術自從2000年發明至今已有10余年,除直接檢測擴增產物外,還可對擴增反應過程進行實時監控,提高了檢測準確性,達到定量檢測的目的。目前對于LAMP技術的實時檢測方法有2種濁度法與熒光染色法。

2.1 濁度法

Mori等［2］研究了LAMP反應中焦磷酸鎂沉淀的形成與擴增產物的量之間的關系,發現兩者生成量之間呈線性關系,且焦磷酸鎂沉淀在400 nm處有吸收峰。日本榮研株式會社通過該原理研制出了專門用于LAMP檢測的實時監控濁度儀,并被廣泛應用。如Mori等［3］通過監測焦憐酸鎂產生的量,從而間接監測LAMP產物的擴增情況,推算待檢測物質雙鏈DNA的起始拷貝數,達到定量檢測的效果。吳少云等［4］利用濁度儀實時監測擴增過程,建立Bt63品系的快速檢測技術體系,并對反應溫度、靈敏度、特異性、穩定性和實際樣品檢測能力進行初步探索。

2.2 熒光染色法

Nagam ine等［5］最早將熒光染料SYBR Green I與LAMP技術結合,通過監測熒光染料與DNA雙鏈結合所產生的信號強度,參照標準曲線,確認擴增反應初始拷貝數,達到了定量檢測的效果。目前該方法既可通過熒光定量PCR檢測,也可通過專用的恒溫擴增PCR儀（如GENIE II等）進行檢測。如Bühlmann等［6］利用GENNIE II對Erωinia amyloυora進行檢測研究,并與實時熒光PCR進行比較,發現其檢測低限可達102·m L-1。

3 LAM P技術在轉基因檢測中的發展

1AMP法廣泛應用于包括病毒［7-9］、細菌［10-12］等傳染性疾病的定性和定量檢測。近年逐漸開始用于轉基因作物檢測領域。隨著轉基因檢測的發展與LAMP技術的成熟,其檢測方向經過了由外源基因檢測到品系檢測的發展過程。

3.1 轉基因外源基因檢測

2004年,Fukuta等［13］利用LAMP技術對轉基因大豆中CaMV35S基因進行檢測,驗證了LAMP技術在轉基因檢測中應用的可能性,并進行LAMP技術檢測檢測靈敏度實驗,發現其檢測低限在0.5%。在國內,周琳華等［14］以轉基因玉米MON810為模板,針對Cry1A（b）抗蟲基因核酸保守序列設計特異性引物,建立LAMP檢測體系。王永等［15］利用LAMP技術對另一種抗蟲基因Cry1A（c）進行了研究,同樣證明該方法可特異性地檢測Cry1A（c）基因,且檢測靈敏度比普通PCR要低10倍。

3.2 轉基因品系檢測

近年來,轉基因檢測研究方向逐步從外源基因檢測轉變為品系檢測［16-18］,LAMP技術在這方面也有著廣泛的研究。Lee等［19］針對MS8、RF3兩種轉基因油菜品系建立了轉基因油菜的LAMP快速檢測方法,檢測限達到0.01%。在轉基因玉米檢測方面,凌莉等［20］建立了轉基因玉米Bt176 LAMP檢測體系；蘭青闊等［21］建立了轉基因玉米MON863 LAMP檢測體系；張雋等［22］建立了轉基因玉米MON89034 LAMP檢測體系；在2011年,Chen等［23］成功建立了特異性檢測7種轉基因玉米品系的LAMP法,用凝膠電泳和添加SYBIGreen I 2種方法來觀察結果,并用建立的方法對實際樣品中的轉基因玉米成分做檢測。其他如轉基因大米Bt63［4］、轉基因大豆GTS 40-3-2和MON89788［24］等許多轉基因品系均已建立了LAMP檢測體系。

4 LAM P技術在轉基因檢測中的應用前景

1AMP技術雖然起步較晚,且存在著如假陽性、氣溶膠污染等問題,但由于該技術檢測靈敏度高、檢測特異性強、操作簡單、快速高效的優點,已在轉基因檢測領域中得到深入研究與應用。且該技術不需復雜儀器操作,隨著相關技術的不斷研究與發展,將在檢驗檢疫等一線工作中占有一席之地,成為轉基因檢測的一種重要檢測手段。

［1］ Notom i T,Okayama H,Masubuchi H,et al.1oop-mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Res, 2000,28（12）：63.

［2］ Mori Y,Nagamine K,Tomita N,et al.,Detection of loopmediated isothermal amp lification reaction by turbidityderived from magnesium pyrophosphate formation［J］.Biochem Biophys Res Commun,2001,289（1）：150-154.

［3］ Mori Y,Kitao M,Tom ita N,et al.Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA［J］.J Biochem Biophys Methods,2004,59：145-157.

［4］ 吳少云,唐大運,李琳,等.1AMP實時濁度法檢測轉基因水稻Bt63品系［J］.食品與機械,2012,28（5）：79-82.

［5］ Nagamine K,Hase T,Notomi T,et al.Accelerated reaction by loop mediated isothermal amplification using loop primers［J］.Mol Cell Probes,2002,16：223-229.

［6］ Bühlmann A,Pothiera J,Rezzonico F,et al.Erωinia amyloυora loop-mediated isothermal amplification（LAMP）assay for rapid pathogen detection and on-site diagnosis of fire blight［J］.JM icrobiol Methods,2013,92：332-339.

［7］ Yoshikawa T,Ihira M,Akimoto S,et al.Detection of human herpesvirus 7 DNA by loop-mediated isothermal amp lification［J］.JClin Micobiol,2004,42（3）：1348-1352.

［8］ Mori N,Motegi Y,Shimamura Y,et al.Development of a new method for diagnosis of Rubella virus infection by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification［J］.J Clin Micobiol,2004,44（9）：3268-3273.

［9］ Parida M M,Santhosh S R,Dash P K,et al.Development and evaluation of reverse transcription loop mediated isothermal amplification assay for rapid and real-time detection of Japanese Encephalitis virus［J］.J Clin Micobiol,2006,44（11）：4172-4178.

［10］ Hara-Kudo Y,Yoshino M,Kojima T,et al.1oop-mediated isothermal amplification for the rapid detection of Salmonella［J］.FEMSM icrobiol Lett,2005,25：155-161.

［11］ Seki M,Yamashita Y,Torigoe H,et al.1oop-mediated isothermal amplification method targeting the lytA gene for detection of Streptococcus pneumoniae［J］.JClin M icobiol, 2005,43（4）：1581-1586.

［12］ Song Tianyan,Toma C,Nakasone N,et al.Sensitive and rap id detection of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli by a loop-mediated isothermal amplification method［J］.FEMS M icrobiol Lett,2005,243：259-263.

［13］ Fukuta S,Mizukam i Y,Ishida A,et al.Real-time loopmediated isothermal amplification for the CaMV-35S promoter as a screening method for genetically modified organisms［J］. Eur Food Res Technol,2004,218：496-500.

［14］ 周琳華,肖維威,吳永彬,等.蘇云金芽孢桿菌Cry1A（b）抗蟲基因LAMP檢測方法的建立與應用［J］.生物技術通報,2012（4）：165-169.

［15］ 王永,蘭青闊,趙新,等.抗蟲轉Bt基因水稻外源轉基因成分環介導等溫擴增技術檢測方法的建立及應用［J］.植物生理與生物技術,2012,18（1）：7-10.

［16］ Holck A,Vaitilingom M,Didierjean L,et al.5，-Nuclease PCR for quantitative event-specific detection of the genetically modified Mon810 MaisGard maize［J］.Eur Food Res Technol, 2002,214：449-454.

［17］ Yang L T,Xu S C,Pan A H,et al.Event specific qualitative and quantitative polymerase chain reaction detection of genetically modified MON863 maize based on the 5，-transgene integration sequence［J］.J Agri Food Chemy,2005,53：9312-9318.

［18］ Shen K L,Li X,W ang S,et al.Establishment and in-house validation of simplex and duplex PCR methods for eventspecific detection ofmaize SYN-E3272-5 using a new referencemolecule［J］.JAOAC In,2010,93：663-675.

［19］ Lee D,La Mura M,A llnutt TR,et al.Detection of genetically modified organisms（GMOs）using isothermal amplification of target DNA sequences［J］.BMC Biotechnol, 2009（9）：7.

［20］ 凌莉,劉靜宇,易敏,等.轉基因玉米Bt176品系特異性環介導等溫擴增檢測方法的研究［J］.食品工業科技, 2013（3）：310-313.

［21］ 蘭青闊,王永,趙新,等.環狀等溫擴增技術快速檢測轉基因玉米MON863的研究［J］.玉米科學,2011,19（1）：31-34.

［22］ 張雋,李志勇,葉宇鑫,等.環介導等溫擴增法檢測轉基因玉米MON89034［J］.現代食品科技,2012,28（4）：469-472.

［23］ Chen L L,Guo J C,Wang Q D,et al.Development of the visual loop-mediated isothermal amplification assays for seven genetically modified maize events and their application in practical samp les analysis［J］.J Agric Food Chem,2011, 59：5914-5918.

［24］ Guan X Y,Guo J C,Shen P,et al.Visual and rapid detection of two genetically modified soybean even ts using loopmediated isothermal amplification method［J］.Food Anal Methods,2010（3）：313-320.

（責任編輯：張瑞麟）

TS 207.3

A

0528-9017（2014）03-0393-03

文獻著錄格式：陳曦,張明哲,吳志毅,等.1AMP技術及其在轉基因檢測中應用研究進展［J］.浙江農業科學,2014（3）：393-395.

2013-10-13

國家質檢總局科技計劃項目（2011IK249）；浙江省科技廳公益性項目（2011C22065）；浙江省科技廳重大專項（2011C12023）；浙江出入境檢驗檢疫局科研項目（ZK200958）

陳 曦（1986-）,男,助理農藝師,碩士,主要從事植物檢疫工作。E-mail：cx9201@163.com。