MTT法檢測幾種多糖和寡糖的體外細(xì)胞毒性

劉 凱，朱麗敏，許寶青，劉新軼，謝 楠，王宇希，馬恒甲

（浙江省杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江杭州 310024）

MTT法檢測幾種多糖和寡糖的體外細(xì)胞毒性

劉 凱，朱麗敏，許寶青，劉新軼，謝 楠，王宇希，馬恒甲

（浙江省杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江杭州 310024）

選用HL7702正常肝細(xì)胞系為靶細(xì)胞,用含不同濃度的多糖和寡糖的細(xì)胞培養(yǎng)液,通過MTT法進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測并評價(jià)多糖和寡糖的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明,Zymosan A、β-glucan、Lam inarin和酵母細(xì)胞壁具有一定的細(xì)胞毒性,茶多糖、香菇多糖、黃芪多糖和海藻多糖等對細(xì)胞毒性較小,其中海藻多糖對細(xì)胞生長具有明顯的促進(jìn)作用。低聚異麥芽糖、低聚果糖、低聚木糖和水蘇糖等4種寡糖在低濃度時(shí)均無毒性,在高濃度時(shí)低聚異麥芽糖具有一定的細(xì)胞毒性,而水蘇糖表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

MTT法；細(xì)胞毒性；多糖；寡糖

功能性寡糖在飼料工業(yè)上稱為益生素或益生元,由于其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,存貯方便,無毒、無害、無殘留,作為一種新型的綠色飼料添加劑日益受到重視［1-2］。自20世紀(jì)60年代以來,世界各國開始對多糖進(jìn)行了廣泛的研究,認(rèn)為其具有增強(qiáng)非特異性免疫的功能［1,3］。目前國內(nèi)外魚用免疫增強(qiáng)劑的研究比較活躍［1-4］,也普遍認(rèn)為其對魚體能起到免疫增強(qiáng)的作用。根據(jù)對甲殼動(dòng)物上的研究結(jié)果, Smith等［5］就免疫增強(qiáng)劑能否增強(qiáng)機(jī)體免疫功能提出了謹(jǐn)慎的觀點(diǎn),并試驗(yàn)證實(shí)葡聚糖等免疫增強(qiáng)劑具有細(xì)胞毒性［6］。本試驗(yàn)就此對幾種常見的寡糖和多糖等非營養(yǎng)性飼料添加劑,采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）進(jìn)行了體外細(xì)胞毒性試驗(yàn),以期豐富糖類非營養(yǎng)性飼料添加劑研究的內(nèi)容。

l 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用多糖和寡糖

Zymosan A（純度＞99%,Wako）是從酵母細(xì)胞壁或酵母細(xì)胞提取的一種富含葡萄糖甘露糖的多糖。β-glucan（純度＞99%,Wako）提取自啤酒糖酵母菌。Laminarin（純度＞99%,Sigma）提取自褐藻掌狀海帶,為單純葡萄糖的聚合物。免疫多糖（即酵母細(xì)胞壁、酵母多糖）（山東濟(jì)寧生物科技有限公司）,富含葡聚糖（含量在20%以上）等多糖。低聚異麥芽糖（純度＞90%）、低聚果糖（純度＞95%）、低聚木糖（純度＞95%）、水蘇糖（即大豆低聚糖,純度＞99%）、茶多糖（純度＞99%）、香菇多糖（純度＞96%）、黃芪多糖（純度＞95%）、海藻多糖（純度＞95%）（國產(chǎn),杭州捷程生物科技有限公司）。

1.2 受試細(xì)胞株

HL7702正常肝細(xì)胞系（湖南湘雅醫(yī)學(xué)院）培養(yǎng)于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中；完全培養(yǎng)基為DMEM,含10%胎牛血清,置于5%CO2,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代比例1∶3,胰酶消化。

1.3 試劑、儀器與測定

MTT、DMSO（Sigma）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清、青鏈霉素雙抗溶液（四季青）；細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔板和酶標(biāo)板（Corning costar）。

酶聯(lián)免疫檢測儀（上海科華試驗(yàn)系統(tǒng)有限公司）,倒置顯微鏡（日本Olympus有限公司）,CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）,電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）,移液槍（德國Eppendorf公司）,液氮貯存罐（樂山亞西機(jī)器廠）,超凈工作臺(tái)（蘇州集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.4 MTT檢測細(xì)胞活性

樣品設(shè)10個(gè)劑量組（10,20,40,80,160, 320,640,1 280,2 560和5 120μg·m L-1）。取處于對數(shù)生長期,生長狀態(tài)良好的細(xì)胞10萬個(gè)接種至96孔板,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,另外設(shè)陰性對照組（0μg·mL-1）和空白對照組。待細(xì)胞貼壁6～8 h后,按照設(shè)定濃度添加到細(xì)胞中。37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后檢測細(xì)胞活性,細(xì)胞活性以細(xì)胞相對增值百分率（RGR,relative growth rate）表示。

RGR/%=（試驗(yàn)組D值/陰性對照組D值）× 100,根據(jù)每組的細(xì)胞增值百分率,按表1轉(zhuǎn)換為0～5級毒性分級評價(jià)［7-8］。

表1 細(xì)胞相對增值率與細(xì)胞毒性分級的關(guān)系

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用WPSOffice 2013和SPSS 13.0 for W indows軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示,P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

從表2可見,不同濃度的低聚果糖和低聚木糖對細(xì)胞生長表現(xiàn)出先促進(jìn)而后逐漸抑制的趨勢,當(dāng)其濃度為10μg·m L-1時(shí),顯著促進(jìn)細(xì)胞的生長；而當(dāng)其濃度超過80μg·mL-1后,則其對細(xì)胞生長影響與對照組無顯著差異。水蘇糖對細(xì)胞的生長影響隨著濃度的遞增而增強(qiáng),當(dāng)其濃度達(dá)到160 μg·m L-1以后,則顯著促進(jìn)細(xì)胞生長。低聚果糖、低聚木糖和水蘇糖對細(xì)胞毒性的評價(jià)等級始終在0～1級。低聚異麥芽糖對細(xì)胞的生長無明顯的促進(jìn)作用,當(dāng)其濃度低于80μg·m L-1時(shí),對細(xì)胞生長無明顯影響；但達(dá)到80μg·m L-1后,則明顯抑制細(xì)胞生長；而濃度達(dá)到1 280μg·m L-1后,其毒性評價(jià)等級即降到2級。

Zymosan A、β-glucan和Laminarin等3種多糖對細(xì)胞生長均未有明顯的促進(jìn)作用。其中Lam inarin濃度達(dá)到20μg·m L-1后,則明顯抑制細(xì)胞的生長；β-glucan濃度達(dá)到10μg·mL-1時(shí),即明顯抑制細(xì)胞的生長；Zymosan A則在濃度為80μg·m L-1以下時(shí),對細(xì)胞生長無明顯影響,而當(dāng)濃度達(dá)到160μg·m L-1后,明顯抑制細(xì)胞的生長。由于Zymosan A溶解性差,640μg·m L-1以上濃度不溶,因此結(jié)果可能受到影響。以上3種多糖的細(xì)胞毒性評價(jià)在0～2級。酵母細(xì)胞壁對細(xì)胞生長的影響與β-glucan類似,濃度達(dá)到10μg·m L-1時(shí)即明顯抑制細(xì)胞的生長,其細(xì)胞毒性評價(jià)等級為1～2級。茶多糖在濃度達(dá)到10μg·m L-1時(shí),明顯促進(jìn)細(xì)胞的生長；當(dāng)達(dá)到2 560μg·m L-1后,無明顯的促進(jìn)作用,其細(xì)胞評級在0～1級。黃芪多糖在濃度低于640μg·m L-1時(shí),對細(xì)胞生長無明顯作用；濃度達(dá)640～2 560μg·m L-1時(shí),對細(xì)胞生長具明顯的促進(jìn)作用,此后明顯抑制細(xì)胞的生長。其細(xì)胞毒性評級在0～1級。香菇多糖對細(xì)胞生長的影響與黃芪多糖類似,但其濃度在80～640μg·m L-1時(shí),對細(xì)胞生長具有明顯的促進(jìn)作用,其細(xì)胞毒性評級在0～3級。海藻多糖在濃度為10～5 120μg·m L-1時(shí),對細(xì)胞生長均有明顯的促進(jìn)作用,其細(xì)胞毒性評級均為0級。

3 小結(jié)與討論

活細(xì)胞特別是增殖的細(xì)胞中能量代謝旺盛,其中線粒體能量代謝過程中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的四甲基偶氮唑鹽還原成藍(lán)紫色的不溶性的甲瓚,沉積在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍,然后用酸化異丙醇溶解。死細(xì)胞則無此功能,無甲瓚的形成,凋亡細(xì)胞的甲瓚形成能力也降低,表現(xiàn)為吸光度降低。根據(jù)對MTT轉(zhuǎn)化能力的高低可判斷細(xì)胞的存活情況,也可了解組織、細(xì)胞的代謝狀態(tài)。通常組織、細(xì)胞代謝活躍時(shí),MTT轉(zhuǎn)化能力較高。目前檢測細(xì)胞數(shù)的常用方法也用［3H］脫氧胸苷攝入法反映細(xì)胞的DNA合成。由于DNA合成與細(xì)胞的能量代謝密切相關(guān),而MTT法反映細(xì)胞的能量代謝,兩種方法的結(jié)果一致,用MTT法代替［3H］脫氧胸苷攝入法同樣可得到滿意的結(jié)果,且MTT法穩(wěn)定客觀,沒有放射性損傷和污染問題［9］。

Zymosan A、β-glucan和Laminarin等均為國外研究較多的不同來源和類型的葡聚糖［1,3］,免疫多糖或稱酵母多糖、酵母細(xì)胞壁,是目前國內(nèi)研究較多的一種免疫添加劑［1,3］,其主要成分均為葡聚糖。從本研究結(jié)果看,這幾種免疫增強(qiáng)劑均具有一定的細(xì)胞毒性,這與Hauton等［6］在甲殼動(dòng)物上的研究結(jié)果類似,表明這幾種免疫增強(qiáng)劑在使用時(shí)一定要注意添加劑量,添加量過高會(huì)對機(jī)體產(chǎn)生一定的傷害。

茶多糖、香菇多糖、黃芪多糖和海藻多糖等也

是國內(nèi)近年來研究較多的多糖類添加劑［1,2］。從本試驗(yàn)結(jié)果來看,這幾種多糖的細(xì)胞毒性均較小,且其中海藻多糖對細(xì)胞生長具有明顯的促進(jìn)作用。已有報(bào)道表明其作為飼料免疫添加劑對動(dòng)物生長具有明顯的促進(jìn)作用［10-11］。

表2 幾種多糖和寡糖體外細(xì)胞毒性測定結(jié)果

低聚異麥芽糖、低聚果糖、低聚木糖和水蘇糖是4種主要的功能性低聚糖,目前已廣泛用于飼料與食品工業(yè)［1-2］。這幾種寡糖低濃度時(shí)對細(xì)胞均無毒性,毒性評價(jià)等級0～1級,其中水蘇糖對細(xì)胞生長表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性,而低聚異麥芽糖在高濃度時(shí)表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性,因此在使用中添加量不應(yīng)過高。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S 91

A

0528-9017（2014）03-0421-04

文獻(xiàn)著錄格式：劉凱,朱麗敏,許寶青,等.MTT法檢測幾種多糖和寡糖的體外細(xì)胞毒性［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014（3）：421-424.

2013-11-13

杭州市科技局科技計(jì)劃項(xiàng)目（20120232B07）；浙江省水產(chǎn)農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(xiàng)（2012C12907）；杭州市財(cái)政專項(xiàng)

劉 凱（1982-）,男,碩士,從事水產(chǎn)養(yǎng)殖方面研究工作。E-mail：liukai0106@hz.cn。