涼血解毒湯對尋常型銀屑病血熱證患者外周血Th17細胞相關細胞因子的影響

田海剛，胡 帥，尤立平，宋佩華，向 青，李紅艷，徐 波，張曉艷★

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.解放軍159醫院，河南駐馬店 463000；

3.中日友好醫院 皮膚科，北京 100029；4.中日友好醫院 臨床研究所，北京 100029）

銀屑病是一種主要以角質形成細胞增殖和混合的皮膚淋巴細胞侵潤為基本特征的慢性炎癥性自身免疫性皮膚疾病[1]。目前發病機制未明，無特異性治療方法。近來研究表明，Th17細胞參與了銀屑病的發病[2]，其產生的IL-17A（IL-17）、IL-17F、IL-21、IL-22是重要的促炎性細胞因子，這些因子在銀屑病角質形成細胞的增殖和炎癥的形成中發揮重要作用。涼血解毒湯是治療尋常型銀屑病血熱證的方劑之一，涼血活血、清熱解毒，且安全有效，但機制不明。本文以尋常型銀屑病血熱證患者為研究對象，測定涼血解毒湯治療對患者外周血Th17細胞效應細胞因子IL-17、IL-17F、IL-21、IL-22表達的影響，以探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2009年1月～2012年1月我院皮膚科門診及住院診斷為尋常型銀屑病血熱證患者30例，18例作為健康對照。其中選取PASI評分＞8以上的中重度患者10例作為治療組[3]。本研究通過本院倫理委員會審查。

（1）診斷標準：西醫診斷標準參照《臨床皮膚病學》[4]，并經組織病理證實。銀屑病血熱證的診斷標準參照《中華人民共和國中醫藥行業標準?中醫皮膚科病癥診斷療效標準》，其主癥包括新皮損不斷出現，以丘疹、斑丘疹為主，皮損基底皮膚顏色鮮紅，刮去鱗屑有點狀出血，有同形反應；次癥包括初發或復發，可有不同程度的瘙癢、心煩、口渴或口干、便秘、尿黃、舌質紅、苔黃、脈數，具備以上主癥及次癥2項以上者即可診斷。

（2）納入標準：①年齡18～60歲，無家族史，皮損面積占體表面積的5%～25%；②3個月內無系統應用免疫抑制劑、糖皮質激素或維甲酸類藥物治療史，近2周內無外用藥物史；③身心健康，無其他內科疾病，血尿便常規、肝腎功能及其它生化指標正常；④患者簽署知情同意書。

（3）排除標準：①關節炎型、紅皮病型和膿皰型銀屑病；②1年內妊娠者、孕婦、哺乳期患者；③有嚴重心、肝、腎疾患，糖尿病、高血壓、高血脂、惡性腫瘤患者；④既往有精神病病史和病毒性肝炎等傳染病病史。

1.2 方法

30例患者于治療前（W0）采集其外周血分離單個核細胞，同時以18例健康人作對照。其中10例患者給予涼血解毒湯（生槐花30g、紫草10g、赤芍10g、白茅根30g、生地黃30g、土茯苓30g、草河車9g、白蘚皮10g、金銀花15g），1劑/d，早晚分2次服用；每2周隨訪1次，療程共6周。于治療6周后（W6）采集外周血分離單個核細胞及提取總RNA。

1.3 外周血單個核細胞的分離制備

取2ml靜脈血用PBS以1：1比例稀釋。在離心管中加入2ml ficoll淋巴細胞分離液 （美國GEH公司），將稀釋后的血樣沿試管壁徐徐加入淋巴細胞分離液ficoll到液面上面（ficoll與稀釋后的抗凝血為1：2）。離心2000r/min，30min，18℃～20℃。離心后管內分為3層，中層為單個核細胞層，將單個核細胞層吸出收集到另一個離心管中。在PBMC中加入6ml PBS，吹打均勻，18℃～20℃，1500rpm，離心10min。去上清液，再次加入6ml PBS洗滌1次，離心條件不變。棄上清可得到高純度的外周血單個核細胞。

1.4 PBMC RNA的提取、檢測及濃度測定

在含有PBMC的EP管中加入1ml Trizol試劑。吹打淋巴細胞團塊至溶解，室溫下靜置10min。在EP管中加入200μl氯仿，充分混合，使其乳化至溶解液呈乳白狀。用天平將EP管配平后，4℃13500rpm離心15min。離心后勻漿液分為3層，上層無色層含有RNA，將上層吸入一新的EP管中。在EP管中加入等量的異丙醇，充分混勻，-20℃條件下靜置15～20 min至沉淀。將EP再次配平后，4℃13500rpm離心10min。棄上清，可見少量白色沉淀吸附于管底。沿管壁加入75%乙醇1ml（4℃預冷），洗滌管壁。配平EP管，4℃12000rpm離心5min。棄去乙醇，殘留部分用小號槍頭吸出，加入15～20μl的DEPC水。沉淀充分溶解后即得RNA溶液。以上操作均在冰塊上進行。取上述RNA溶液2μl，以DEPC水為空白對照，在Naonodrop紫外分光光度計上分別讀取RNA的總濃度值（μg/μl），以及A260/A280的數值鑒定RNA純度。A260／A280的比值均在1.8～2.0（Trizol，美國Invitrogen公司）。

1.5 逆轉錄合成cDNA（RT反應）

根據逆轉錄試劑盒（美國ABI公司）提供的方法將總RNA逆轉錄為cDNA。

逆轉錄反應體系（冰上配制）：

2×RT Buffer 10μl；2×RT Enzyme Mix 1μl；總RNA 2μg；加DEPC水至20μl，混勻，離心。逆轉錄條件：37℃，1 h；95℃，5min；-20℃，保存備用。

1.6 實時熒光定量RT-PCR反應

使用看家基因（18S）作內部參比（endogenous control/reference）。PCR反應體系 （冰上配制）：TaqMan Gene Expression Master Mix（2×）10μl；TaqMan Gene Expression Assay（20×）1μl；ddH2O 7μl；cDNA template 2μl。混勻，離心，共20μl。實時熒光定量PCR反應條件：50℃2min；95℃10min；95℃15s；60℃1min，40個循環。細胞因子熒光探針和內參基因均購自美國ABI公司。

1.7 實驗結果分析

為保證各樣本檢測值的可比性，采用18S rRNA做為內參基因，每例樣品重復制備3次，樣品重復測定3次，基因表達相對變化采用△△Ct法處理數據。△Ct=目的基因Ct值-內參基因Ct值，△△Ct=樣本△Ct值-對照△Ct值。

1.8 統計學處理

應用SPSS17.0軟件進行統計學分析。數據正態分布時，進行獨立樣本t檢驗，治療前后行配對t檢驗；不服從正態分布時，選擇非參數檢驗。

2 結果

2.1 一般資料分析

收集尋常型銀屑病血熱證患者共33例，脫落3例，最終有效30例，其中男20例、女10例；年齡18～65歲，平均33.83歲；病程1周～2年，平均119.38d；皮損面積5%～30%，平均16.40%；患者PASI評分為2.4～26.1分，平均8.997分，其中輕度（PASI＜8分）20例；中重度（PASI≥8分）10例。健康對照共18例，男10例，女8例；平均年齡32.06歲。2組在年齡、性別構成方面無統計學差異（P＞0.05）。

2.2 Th17細胞相關因子mRNA相對表達量

表1示，2組各細胞因子的表達量均存在顯著性差異（均P＜0.05）。

2.3 涼血解毒湯治療降低Th17細胞因子mRNA表達水平

表1 PBMC中各效應細胞因子mRNA相對表達（xˉ±s）

表2 治療前后PBMC中Th17細胞因子mRNA變化

表2示，W6時各細胞因子的水平均較W0時顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

3 討論

銀屑病古稱“白疕”，屬于皮膚病之頑疾。以著名中醫皮科專家趙炳南[5]為代表的當代醫家提出銀屑病病因的血熱論思想。涼血解毒湯正是在此思想的指導下創立而成，治療血熱型銀屑病療效較好。目前研究認為銀屑病是一種T細胞介導的免疫性疾病，尤其是產生IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22等效應細胞因子的Thl7細胞，已被越來越多的證據表明，其在介導銀屑病以及其他自身免疫性疾病和炎癥性疾病損傷中發揮重要作用[6]。那么，涼血解毒湯治療銀屑病的有效是否與Th17細胞及其相關細胞因子有關，為此，本研究對銀屑病患者和健康對照以及涼血解毒湯治療前后患者外周血中Th17效應因子（IL-17、IL-17、IL-21、IL-22）mRNA表達水平進行了比較分析。

既往研究表明，與健康對照相比，疾病組外周血和皮損中的Th17細胞數量及其效應細胞因子IL-17、IL-17F、IL-21、IL-22的mRNA表達水平明顯升高[7，8]，經過有效治療后，升高的細胞數和因子表達會出現降低。本研究結果與上述一致，經涼血解毒湯治療后，患者外周血中的Th17細胞因子的mRNA表達水平降低，這部分印證了Th17細胞及其細胞因子與銀屑病的發病有關，表明在尋常型銀屑病血熱證患者PBMC中存在異常活化的Thl7細胞，而涼血解毒湯可能對活化的Th17細胞具有抑制作用。

IL-17，是Th17細胞發揮效應機制的最主要細胞因子之一，而NK、iNK和γδT細胞也分泌IL-17[9]。IL-17參與中性粒細胞增生，成熟和趨化，誘導中性粒細胞移行到銀屑病皮損，表現為Munro微膿瘍；誘導血管內皮細胞生長因子（VEGF）生成，參與銀屑病皮損內毛細血管增生及擴張[10]。研究發現，銀屑病皮損IL-17A mRNA的含量明顯高于非皮損處，而且與皮損嚴重程度成正比[11]。經依曲替酸治療后患者皮損區IL-17A mRNA和蛋白的表達明顯下降。IL-17F和IL-17A，是具有55%氨基酸類似性的同型二聚體細胞因子[12]，NK、iNK和γδT細胞也分泌IL-17F[9]，其具有與IL-17A相似的生物學活性。研究顯示，IL-17F mRNA在鼠的銀屑病炎癥模型和人類銀屑病中的表達水平升高[13，14]。本研究顯示，銀屑病患者PBMC中IL-17、IL-17F的mRNA水平高于健康對照組，經涼血解毒湯治療后患者IL-17A和IL-17F的mRNA表達下降，與既往研究部分一致。表明IL-17、IL-17F可能參與了血熱證銀屑病的發病，涼血解毒湯可能通過抑制Th17和（或）其他分泌IL-17、IL-17F細胞的活性下調了IL-17、IL-17F的mRNA表達。

IL-21主要由激活的CD4+T細胞及Th17細胞表達，也會表達在其他的髓樣細胞和T細胞[15]。在人的銀屑病異種移植模型中，IL-21功能的阻斷能消除炎癥和減弱角質形成細胞的增殖和表皮的肥厚[16]。研究發現，銀屑病患者的皮損處IL-21的蛋白和mRNA均明顯高于同一患者的非皮損和健康人[16]。IL-22主要是由Th17和Th22細胞產 生，Th1，NK和CD8+T細 胞 也 分 泌IL-22[17，18]。IL-22與角質形成細胞上的IL-22受體結合后，在免疫細胞和KC間形成橋梁作用，活化STAT3通路，引起各種細胞因子的表達，促進角質形成細胞異常增生和遷移，誘發棘層肥厚，角化不全，并下調表皮分化相關基因的表達，引起銀屑病樣損害，是銀屑病發病中重要的細胞因子[19]。本實驗結果與國內外的研究結果部分一致，提示IL-21、IL-22可能參與了銀屑病的發病，而涼血解毒湯的作用機制可能正是抑制了IL-21、IL-22的促炎和促增殖作用以及其他分泌IL-21、IL-22細胞的活性和（或）功能，下調了IL-21、IL-22的表達。

血熱證銀屑病的中醫病機屬血分蘊熱，發于肌膚，氣血瘀滯，血分熱毒為其主要病因。涼血解毒湯治療前，尋常型銀屑病血熱證患者外周血Th17效 應 細 胞 子IL-17、IL-17F、IL-21、IL-22mRNA水平升高可能是構成尋常型銀屑病血熱證血分毒熱的病理基礎，治療后這些因子水平降低可能是涼血解毒湯對Th17細胞活化的抑制作用所致，或者抑制了其他分泌這些細胞因子的細胞的活性和或功能，直接或間接下調了Th17細胞效應因子的表達，從而有效治療銀屑病。但本研究由于樣本量偏小，故此結論并不能完全解釋涼血解毒湯的療效機制，仍需要大樣本深入的研究。

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