羅漢松果內生真菌次級代謝產物研究

楊春貴，李 琳，魏佩瑤，羅都強

(河北大學藥物化學與分子診斷教育部重點實驗室，河北 保定 071002)

目前，相關研究人員已經從羅漢松屬植物體內分離出大量內生真菌，某些成分還具有抑癌活性、抗菌活性等[1]。羅漢松果內生真菌Pestalotiopsis zoneata為擬盤多毛孢屬真菌，關于其次級代謝產物的研究還比較少，因此本實驗對羅漢松果內生真菌的次級代謝產物進行了化學成分研究，為其進一步研究提供科研依據。

1 儀器與材料

BUCHI R-210型旋轉蒸發儀，Bruker AVANCE III-600核磁共振譜儀，Waters高效液相色譜儀，ZF7三用紫外分析儀，Apex-Ultra7.0T高分辨傅里葉變換離子回旋質譜儀，吹風機，制備薄層色譜硅膠GF254，DL-1電烤爐，電子天平，柱層析色譜硅膠，Sephadex LH-20凝膠等。菌株:羅漢松果內生真菌Pestalotiopsis zoneata，由河北大學藥物化學與分子診斷教育部重點實驗室保存提供。

2 發酵與提取分離

2.1 種子液制備及擴大培養發酵

將羅漢松果內生真菌P.zoneata菌種接種于cPDA種子培養基(6L)中，搖床150r/min，26℃下培養8天;制作大米培養基20L(500mL三角瓶)高溫高壓滅菌后，將10%種子液轉接到培養基內，26℃下持續發酵35天。

2.2 提取及分離純化

丙酮萃取菌體得浸膏33g，拌硅膠上柱子，將石油醚/乙酸乙酯按比例梯度:100/0，95/5，90/10，80/20，50/50 洗脫得到Y1-Y5五個餾分。Y2經硅膠柱兩次層析，再經Sephadex LH-20(CH3OH)凝膠分離得化合物3(15mg)和化合物5(17mg);Y4經硅膠柱層析，再重結晶得化合物4(20mg);Y5經硅膠柱層析，再上凝膠(CH3OH)分離及制備薄層(Pre-TLC)，得到化合物1(8mg)和化合物2(17mg)。

3 結構鑒定

化合物1:4-羥基-4-甲基四氫-2H-吡喃-2-酮，分子式為C6H10O3，M=130，無色晶體。1H-NMR(600MHz，CDCl3)δH:1.38(3H，s)，2.65(1H，d)，2.67(1H，d)，4.34(1H，m)，4.59(1H，m).13C-NMR(150MHz，CDCl3)δC:171.17(s，C-1)，44.60(t，C-2)，67.97(s，C-3)，35.74(t，C-4)，66.23 C-5)，29.55(q，C-6)。以上數據與文獻[2]一致。

化合物2:7-羥基-5-甲氧基-4，6-二甲基-7-O-a-L-鼠李糖苯酞，分子式為 C17H22O8，M=354，無色油狀。1H-NMR(600MHz，CD3OD):δH，1.24(3H，d)，2.21(3H，s)，2.28(3H，s)，3.52(1H，t)，3.80(3H，s)，3.91(1H，dd)，4.02(1H，m)，4.50(1H，m)，5.24(2H，d)，5.53(1H，d)。13CNMR(150MHz，CD3OD)δC:169.9(s，C-1)，68.4(t，C-2)，147.1(s，C-3)，120.8(s，C-4)，153.5(s，C-5)，125.2(s，C-6)，163.0(s，C-7)，111.7(s，C-8)，105.0(d，C-9)，70.8(d，C-10)，70.6(d，C-11)，70.9(d，C-12)，72.0(d，C-13)，10.0(q，C-14)，59.5(q，C-15)，9.2(q，C-16)，16.6(q，C-17)。以上數據與文獻[3]一致。

化合物3:4-羥基苯甲酸，分子式為C7H6O3，M=138，無色晶體。1H-NMR(600MHz，CD3OD)δH:7.89(2H，d)，6.83(2H， d).13C-NMR(150MHz， CD3OD) δC:121.4(s，C-1)，131.6(d，C-2)，114，6(d，C-3)，161.9(s，C-4)，114.6(d，C-5)，131.6(d，C-6)，168.7(s，C-7)。以上數據與文獻[4]一致。

化合物4:4-羥基苯乙酸，分子式為C8H8O3，M=152，無色晶體。1H-NMR(600MHz，CD3OD)δH:7.10(2H，d)，6.74(2H，d)，3.50(2H，s)。13C-NMR(150MHz，CD3OD)δC:125.4(s，C-1)，129.9(d，C-2)，114.8(d，C-3)，155.9(s，C-4)，114.8(d，C-5)，129.9(d，C-6)，39.7(t，C-7)，174.9(s，C-8)。以上數據與文獻[5]一致。

化合物5:4-羥基苯乙醇，分子式為C8H10O2，M=138，無色晶體。1H-NMR(600MHz，CD3OD)δH:7.05(2H，d)，6.72(2H，d)，3.74(2H，t)，2.73(2H，t)。13C-NMR(150MHz，CD3OD)δC:129.5(s，C-1)，129.5(d，C-2)，114.7(d，C-3)，155.3(s，C-4)，114.7(d，C-5)，129.5(d，C-6)，63.1(t，C-7)，38.0(t，C-8)。以上數據與文獻[6]一致。

4 結語

本文通過高效液相色譜制備法、凝膠色譜分離法、正反向硅膠柱色譜分離法以及制備薄層層析色譜分離法對羅漢松果內生真菌的次級代謝產物進行了分離純化，并采用NMR和MS等現代波譜分析法對其進行了結構鑒定，從中首次分離鑒定出了5個化合物。該方法準確可靠，為羅漢果次級代謝產物的研究提供了科學依據。

[1]孫端芳，冉雪琴，王家福.一株產紫杉醇羅漢松內生真菌的分離和鑒定[J].微生物學報，2008，48(5):589-595.

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[3]XING JIANGUANG，DENG HUIYING，LUO DUQIANG .Two new compounds from an endophytic fungus Pestalotiopsis heterocornis[J].Asian Natural Products Research，2011，13(12):1069-1073.

[4]馮寶民，劉菁琰，王惠國，等.紅火麻化學成分的分離與鑒定[J].沈陽藥科大學學報，2011，28(5):364-367.

[5]李林，李小年.蠐螬化學成分研究[J].大理學報，2012，11(9):1-4.

[6]楊云，張寒娟，朱振華，等.心葉淫羊藿化學成分研究[J].中藥材，2009，32(7):1051-1053.