轉基因檢測技術與標準物質研究概述

陳銳等

摘 要：轉基因技術在農業領域的應用與發展十分迅猛，相應的檢測技術體系也在不斷更新與進步。本文從檢測技術與標準物質兩個方面對當前轉基因檢測技術體系的研究現狀和發展趨勢進行了概述。

關鍵詞：轉基因；檢測技術；標準物質

中圖分類號：S188 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.03.003

轉基因技術在提高作物抗性、增加糧食產量、改善農產品品質以及減少農藥使用與污染等方面正深刻改變著現代農業。據統計，2012年全球轉基因作物種植面積已達1.7億hm2，超過全球耕地面積的10%，共計60個國家和地區累計審批1 045項轉基因作物用于食品、飼料和環境釋放，涉及25個物種、196個轉化事件[1]。伴隨轉基因作物種植面積的激增，關于轉基因生物及其產品成分對人類健康和生態環境影響的關注度也與日俱增。

目前國際上在轉基因檢測與標識管理方面已形成部分共識性文件、評價原則及檢測標準，但因不同國家和地區的國情與政策導向不同，轉基因產品在標簽的閾值范圍、標識方式等管理制度上還存在較大差異[2-4]。不同的標識制度直接關系到轉基因產品的進出口檢驗、國際貿易互認等諸多問題，加之公眾對轉基因食品越來越關注，轉基因檢測技術近年來得到了快速發展和廣泛應用。筆者就轉基因檢測技術及相關標準物質研究現狀進行概述。

1 轉基因檢測技術概況

轉基因檢測的對象主要是外源插入基因的核酸序列或其蛋白表達產物。針對蛋白的檢測，因其抗體制備成本較高，并且由于外源基因的低水平和時空特異性表達、蛋白的不穩定性，以及多種干擾免疫應答物質的存在，使蛋白檢測的應用范圍受到一定程度的限制。針對核酸的檢測方法靈敏度高、適用范圍廣，是當前轉基因檢測的主流方法。按目的轉基因檢測可分成3個層次：一是通過檢測通用的遺傳元件來初步篩查樣品中是否含有轉基因成分；二是針對轉化事件的指定特征進行品系特異性鑒定；三是定量分析轉基因成分所占比重。

1.1 針對核酸的檢測技術

聚合酶鏈式擴增技術（Polymerase chain reaction， PCR）是目前應用最廣泛的轉基因檢測方法，具有高度特異性和靈敏度，可用于定性或定量分析[5]。PCR法按檢測對象可分為元件特異性（如p35S、tNOS）[6]、基因特異性（如cry1Ab，cp4-epsps）[7]、構建特異性[8]和品系特異性4種[9-11]。在標準PCR方法基礎上還存在多種改良方法，多重PCR、巢式PCR、半巢式PCR在降低成本、提高通量和靈敏度方面具備優勢[12]。反向PCR（Inverse PCR）[13]，熱不對稱PCR（Thermal asymmetric interlaced PCR， TAIL-PCR）[14]和連接介導PCR（Ligation mediated PCR， LM-PCR）[15-16]在側翼序列擴增和鑒定方面應用廣泛。

定量PCR（Quantitative PCR， qPCR）是目前最有效的轉基因定量檢測方法，包括競爭定量PCR[17]和實時熒光定量PCR法[18-19]，其中后者利用熒光標記可實時監控擴增過程，根據待測物初始濃度與Ct（Threshold Cycle）值成正比原理，可精確定量靶標DNA。實時熒光定量PCR具有自動化和高精度等優點，但實驗成本較高，對操作人員有技術要求，一般需要種間特異、低拷貝的內標準基因或標準物質作為參照。

環介導恒溫擴增技術（Loop mediated isothermal amplification， LAMP）是由Notomi等人于2000年建立的一種全新的鏈置換擴增法（Strand displacement amplification， SDA）[20]。該方法針對靶基因的6個區域設計4條特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件下完成復雜的擴增過程，產生階梯狀電泳條帶，反應結果還可以通過擴增副產物焦磷酸鎂沉淀或特定熒光染料來判斷。LAMP法對儀器依賴度低，具有高效、靈敏、直觀的特點，但易出現假陽性，在轉基因檢測中有一定應用[21-24]。

基于核酸的檢測方法還包括核酸印記法（Southern blot）、基因芯片法（Microarray）和生物傳感器法（Biosensor）。核酸印記雜交能夠精確區分高度同源序列，但對樣品純度要求較高，操作流程繁雜?；蛐酒軌蛞淮涡詫Χ喾NDNA序列進行定性、定量分析，具有高通量和自動化的特點[25]。生物傳感器法依賴靈敏的電化學技術，通過固定在傳感器表面的特異探針與靶標DNA結合后產生的電信號來檢測，是一種高靈敏度的檢測方法[26]。

此外，越來越多的新技術正不斷的應用于轉基因檢測領域，包括NASBA擴增技術（Nucleic acid sequence based amplification）[27]、超分支滾環擴增技術（Hyper-branched rolling cycle amplification， HRCA）[28]、焦磷酸測序技術（Pyro-sequencing）[29]、高通量測序技術（High-throughput sequencing）[30]、毛細管電泳技術（Capillary electrophoresis， CE）[31]、高效液相色譜（High performance liquid chromatography， HPLC）[32]、近紅外光譜技術（Near infrared spectroscopy， NIS）[33]和生物條形碼技術[34]等。

1.2 針對蛋白質的檢測技術

基于蛋白的檢測方法主要是以抗原抗體互作的免疫學理論為基礎，通過檢測外源基因表達的蛋白產物進行測定，主要包括蛋白質印跡法（Western blot）、酶聯免疫吸附法（Enzyme linked immuno-sorbent assay， ELISA）和側向流動免疫測定法（Lateral flow devices， LFD）[35]。

蛋白質印跡法是檢測復雜混合物中特異蛋白的有力工具，它將電泳的高分離能力、抗體特異性和酶的高效催化結合起來，靈敏度可達1～5 ng[36]。ELISA法通過可溶性的抗原或抗體在固相載體上發生免疫反應后，借助比色或熒光反應鑒定目標蛋白，檢測靈敏度通?？蛇_0.1%[37-38]。LFD法是廣泛使用的試紙條檢測法，該方法將特異抗體交聯到顯色劑和硝化纖維素試紙上，通過觀察控制線和檢測線的顏色變化來判斷檢測結果[39]。該方法樣品前處理簡便快捷，無需特殊儀器，但靈敏度較低，主要應用于田間快檢和現場初篩抽查。

1.3 轉基因檢測數據庫

轉基因檢測相關數據庫主要有GMDD（GMO Detection method database）[40]、GMO Compass、CERA、BCH以及ABF等。其中GMDD數據庫整合了外源插入基因及其旁側序列、檢測方法、引物序列、協同驗證信息、內參基因及有證參照物質等信息，共涉及155種商業化轉基因作物品系，是比較全面的轉基因檢測方法數據庫。其他數據庫主要收錄了轉基因相關的技術信息、品系特征、風險評估、產品標識管理和商業化現狀等信息。

2 轉基因檢測標準物質現狀

2.1 標準物質的定義

國際標準化組織（ISO）對標準物質（Reference material， RM）的定義是：具有一種或多種足夠均勻和很好確定了的特性值，用以校準儀器設備，評價測量方法或給材料賦值的材料或物質[41]。標準物質作為實物形式的計量標準，可以是純的或混合的氣體、液體或固體，穩定性、均勻性、準確性和量值溯源性是其基本屬性。標準物質按級別一般可分為基準標準物質（Primary reference material， PRM）、有證標準物質（Certified reference material， CRM）和工作級標準物質（Secondary reference material， CRM）。我國將標準物質分為一級標準物質（國家級）和二級標準物質（部門級）[42]。

2.2 我國標準物質的管理

我國最早的標準物質可追溯到1952年的第一批冶金國家標準樣品，之后1988年國家標準總局批準成立了全國實物標準委員會，負責標準樣品的規范化管理；1996年，國家質量監督檢驗檢疫局批準成立了國際標準樣品委員會（ISO/REMCO）中國委員會，負責與國際接軌并根據工作需要成立了冶金、有色金屬、環保、農藥、氣體化學品、無損探傷、酒類等7個分會及多個專業技術工作組[43]。目前，我國的標準物質管理由國家質檢總局計量司負責，國家質檢總局委托中國計量測試學會組織各行業專家成立全國標準物質管理委員會，制定工作導則與技術規范，并負責標準物質的行政審批和評審考核等工作。

2.3 轉基因檢測標準物質分類

轉基因檢測標準物質（Reference material for GMO detection）屬于生物標準物質，是具有一種或多種足夠均勻并很好確定了相關的特性值，在轉基因檢測中用以校準測量裝置、評價測量方法或給材料賦值的一種材料或物質[44]。目前轉基因檢測標準物質主要有基體標準物質和DNA標準物質兩類，其中后者又可分為質粒DNA、基因組DNA和擴增子DNA3種。由于不同的穩定性、準確度和制備工藝，不同的轉基因標準物質在實際應用中各有利弊，其中基體標準物質和質粒DNA標準物質應用范圍最廣。

基質標準物質是由植物種子或器官研磨加工后混合而成，主要通過重量法進行制備。制備過程一般利用精磨手段來減小顆粒體積差異從而提高均勻性，但此過程又不可避免的會造成DNA降解，目前歐盟開發的冷凍研磨和干樣混合技術能有效地解決此問題。此外，植物特異性、組織倍性和親本特性也是影響基質標準物質均勻性和準確性的重要因素[45-46]。例如，種子的胚、胚乳和果皮的倍性不同，即各組織的DNA含量不同，若制備過程中使用的組織所占比例不同，必然會影響最終結果。質粒標準物質是包含待測目的基因和內標基因的重組質粒分子，可作為標準陽性物質替代物，也可根據分子量換算計算拷貝數，在定量PCR檢測中應用廣泛[47]。質粒標準物質的量值用DNA質量和轉化因子（Conversion factor， CF）表示，并需要通過多家實驗室的聯合實驗來定值。

比較而言，基質標準物質制備成本高，工藝復雜，而質粒標準物質具有廉價、易富集、使用方便和均勻性好等特點，尤其是在陽性物質難以獲得的情況下，質粒標準物質具有絕對優勢[48]。

2.4 轉基因檢測標準物質研發現狀

目前生產轉基因檢測標準物質的機構主要有歐盟聯合研究中心下屬的標準物質與測量研究所（Institute for Reference Materials and Measurements， IRMM），美國的油脂化學家學會（American Oil Chemists Society， AOCS）和日本農林水產省下屬的食品綜合研究所。

IRMM自1997年以來，根據歐盟標簽制度規定的閾值，陸續研發了質量比從0到100%不等的轉基因陽性標準物質，其中包括玉米、大豆、馬鈴薯、甜菜和棉花在內的有證標準物質20余種。AOCS主要生產純品形式的標準物質，包括油菜、棉花、水稻、大豆和玉米等農作物。日本食品綜合研究所與NIPPON公司合作研發轉基因標準物質，但產品只在國內使用，不對外銷售，目前已制備3種基體標準物質（GTS40-3-2、MON810和GA21）和2類質粒標準物質（大豆和玉米）。目前市場上可售的有證標準物質主要由IRMM和AOCS生產，基體標準物質居多，質粒標準物質較少。

我國轉基因標準物質研究相對滯后，農業部已于2011年開展重大專項攻關，建立了包括玉米、水稻、小麥、棉花和大豆在內的基體、質粒和基因組DNA標準物質研制體系，并取得了階段性成果。此外，上海交通大學[49]、中國計量科學研究院[50-51]、中國檢驗檢疫科學研究院[52]等多家單位也陸續開展了轉基因標準物質的研制工作。

3 展 望

隨著世界人口增長與糧食短缺的矛盾日益加劇，轉基因技術在農業領域的研發和應用前景一片光明。新一代商業化轉基因作物性狀正趨向多樣化、復雜化，轉基因食用安全問題也正逐步成為公眾熱議的焦點，這使得建立快速、精準、高通量的轉基因檢測體系成為必然趨勢。其中，標準物質作為分析測量的物質基礎和質量管理工具，其制備技術和應用程度能夠直接反應檢測技術體系的水平。因此，大力發展符合國情的、科學可靠的轉基因檢測技術與標準物質，掌握核心技術，搶占領域高地，不僅關乎國家利益，而且對維護轉基因產業的良性發展以及保障人類健康都具有十分重要的意義。

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