骨髓間充質干細胞移植在肺氣腫大鼠模型肺組織內定植研究*

何樺趙祝香張穎

骨髓間充質干細胞移植在肺氣腫大鼠模型肺組織內定植研究*

何樺①趙祝香①張穎①

目的：觀察骨髓間充質干細胞移植在肺氣腫大鼠模型肺組織內的定植情況。方法：選擇健康SD大鼠34只，按隨機數字表法分為MSCs干預組（A組，10只，慢阻肺大鼠，尾靜脈輸注MSC 1×106個/mL），肺氣腫模型組（B組，10只，慢阻肺大鼠，尾靜脈輸注等體積PBS）及MSC對照組（C組，10只，正常大鼠，尾靜脈輸注MSCs 1×106個/mL），正常對照組（D組，4只，正常大鼠，尾靜脈輸注等體積PBS），采用煙熏法復制大鼠肺氣腫模型。全骨髓培養法體外培養擴增雄性SD大鼠來源的MSCs，經GFP標記細胞后將其經尾靜脈注入肺氣腫模型SD大鼠體內，24 h內處死大鼠，取肺組織迅速冰凍切片，共聚焦激光顯微鏡下觀察觀察轉染GPF的間充質干細胞在大鼠肺內定植情況。結果：成功培養具有分化潛能的骨髓間充質干細胞，MSCs傳至第4代時有99.5%表達CD44、99.6%表達CD29等間充質干細胞表面標志，僅有0.4%表達CD34、1.0%表達CD45單核細胞以及造血干細胞表型；成功復制大鼠肺氣腫模型，香煙煙霧暴露組（A、B組）平均肺泡間隔為（119.0±26.2）μm，高于對照組（C、D組）的（89.8±17.3）μm，差異有統計學意義（P＜0.05）；平均肺泡數為（173.9±68.3）個/mm2低于對照組的（280.3±104.0）個/mm2，差異有統計學意義（P＜0.05）；顯微共聚焦發現MSCs經尾靜脈注入大鼠體內24 h后可見A組大鼠肺組織內轉染綠色熒光蛋白質粒的MSCs，而B組、C組及D組均未見轉染熒光。結論：骨髓間充質干細胞經尾靜脈輸注入后可在肺氣腫模型大鼠肺內定植，為MSCs治療慢阻肺可能提供理論依據。

骨髓間充質干細胞； 肺氣腫； 移植

慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺，COPD）嚴重影響人類健康，與慢性支氣管炎及阻塞性肺氣腫密切相關，而阻塞性肺氣腫可出現肺泡、支氣管上皮細胞的損傷，造成肺實質結構的破壞，且隨著病情進展，肺功能進行性下降。現行的內科治療手段是盡早去除致病因素，最大限度減少損傷細胞的數量及損傷程度，但往往無滿意的療效。肺移植是目前終末期間質性肺疾病、慢阻肺患者唯一有效的治療方法，但由于存在供體數量的下降、免疫排斥反應等問題而限制了其應用。目前人民迫切尋求一種新的、組織替代療法來治療這類不可逆的肺部疾病。骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）由于來源方便、分離簡單、擴增迅速，可以取材于患者本人，傳代擴增并定向誘導為特異細胞后，回輸給患者本人，安全性高，免疫原性低，且具有多向分化潛能引起廣泛的關注，被認為是細胞移植和組織工程的種子細胞[1-3]。本實驗將骨髓間充質干細胞（MSCs）經尾靜脈注入肺氣腫大鼠體內，觀察MSCs植入大鼠體內后在肺組織中的存活，為MSCs治療慢阻肺提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 大鼠MSCs的體外分離與鑒定 （1）MSCs的分離與培養：無菌條件下取出大鼠雙側股骨和脛骨，無菌PBS沖洗骨髓腔獲取骨單細胞懸液，將單細胞懸液1000 r/min，離心5 min，10%胎牛血清的DMEM培養液5 mL重懸細胞，接種于培養瓶37 ℃、5% CO2培養箱培，每3天換液一次。倒置相差顯微鏡逐日觀察并記錄的形態及生長情況，當細胞融合達90%時，按1∶3比例傳代培養。取第4代MSCs進行鑒定。（2）流式細胞儀檢測細胞CD表型：取第3 代MSCs，生長至90%融合時PBS洗滌2次，1×106的MSCs重懸于含0.1 mL PBS的PE管中，各管加入CD34、CD45、CD44及CD29，加入抗兔FITC，室溫孵育40 min，流式細胞儀檢測上述細胞表型，陰性對照為未加熒光抗體的MSCs細胞懸液。

1.2 移植MSCs的培養、標記 取6孔培養板，向每孔中加入2 mL含（1～2）×105個細胞培養液，37 ℃ 5% CO2培養至40%～50%匯合時轉染（匯合過度，不利于轉染細胞）。PBS洗細胞，10% FBS的DMEM/F12繼續培養，72 h后熒光顯微鏡下觀察轉染細胞的綠色熒光，棄病毒混合培養液，流式細胞儀檢測轉染效率，轉染后攜帶GFP的MSCs（GFP-MSCs）按1：3傳代培養，取第4代MSCs進行鑒定。

1.3 實驗動物分組及大鼠肺氣腫模型建立 SD大鼠34只按隨機數字表分為四組，MSCs干預組（A組，10只，慢阻肺大鼠，尾靜脈輸注MSCs 1×106個/mL），肺氣腫模型組（B組，10只，慢阻肺大鼠，尾靜脈輸注等體積PBS）及MSCs對照組（C組，10只，正常大鼠，尾靜脈輸注MSCs 1×106個/mL），正常對照組（D組，4只，正常大鼠，尾靜脈輸注等體積PBS）。采用煙熏法復制大鼠肺氣腫模型。將A、B組大鼠置于煙室內，采用靜式吸入染毒方法，10支椰樹牌香煙置于吸煙孔內，點燃香煙，每支香煙每分鐘吸一次，35 mL/次，收集主流煙氣和側流煙氣，通過塑料軟管與熏煙箱相連，將煙霧導入熏煙箱。其間，每隔5秒將箱內流風機開啟10 s，使箱內氣體分布均勻。8 min香煙點燃完畢，關閉吸煙系統。動物每次暴露45 min，45 min后取出動物，清洗熏煙箱。2次/d，共12周。煙霧暴露時動物可在箱內自由取食飲水。按上述方法將MSCs干預組第3代的轉染GFP質粒的間充質干細胞（每只1×106個/mL）尾靜脈注入A組大鼠體內，B組注入等體積PBS；C組在相同時間內注入1×106個/mL骨髓間充質干細胞等，D組注入等體積PBS，注入后24 h內處死大鼠，取肺組織迅速冰凍切片，共聚焦激光顯微鏡下觀察觀察轉染GPF的間充質干細胞在大鼠肺內定植情況。第3代的轉染GFP質粒的間充質干細胞（每只1×106）進行下一步實驗。

1.4 統計學處理 采用SPSS 12.0統計學軟件對數據進行統計分析，計量資料以（±s）表示，比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MSCs培養與鑒定 原代培養的MSCs第24小時即可見梭形細胞貼壁生長，到第6天時有大量梭形細胞呈克隆生長，第10天左右細胞可長滿皿底。細胞長滿后與成體MSCs相似，呈旋渦狀（圖1）。按1：3進行傳代培養，細胞在體外培養可穩定傳至48代，在第4代做流式細胞表型鑒定，符合目前公認間充質干細胞細胞表型標志。經流式細胞儀檢測，分離細胞傳至第4代時有99.5%表達CD44、99.6%表達CD29等間充質干細胞表面標志，0.4%表達CD34、1.0%表達CD45單核細胞以及造血干細胞表型（圖2）。

圖1 MSCs的原代培養（×400）

圖2 間充質干細胞表面標志的表達

2.2 SD大鼠肺氣腫模型的建立 香煙煙霧暴露后A、B組大鼠小氣道上皮呈鋸齒狀增生增厚，上皮脫落，纖毛倒伏，氣管內見大量炎性滲出物，管壁結締組織增生，可見炎性細胞，及淋巴小結。肺泡結構紊亂，肺泡壁斷裂，肺泡腔擴大，部分融合成肺大皰（圖3A）。C、D對照組大鼠小氣道黏膜上皮完整，纖毛未見黏連脫落，管壁規整未見增厚，未見炎細胞浸潤，管腔內未見炎性滲出物，肺泡腔未見病理性擴大（圖3B）。

香煙煙霧暴露組（A、B組）平均肺泡間隔為（119.0±26.2）μm，高于對照組（C、D組）的（89.8±17.3）μm，差異有統計學意義（P＜0.05）；平均肺泡數為（173.9±68.3）個/mm2低于對照組的（280.3±104.0）個/mm2，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 大鼠肺組織病理學改變情況（±s）

表1 大鼠肺組織病理學改變情況（±s）

肺泡數（個/mm2）組別 支氣管數（只）平均肺泡間隔（μm）對照組（n=14） 27 89.8±17.3 280.3±104.0香煙組（n=20） 28 119.0±26.2 173.86±68.3 F值 - 3.8 4.7 P值 - ＜0.01 ＜0.01

2.3 各組轉染GPF綠色熒光蛋白的表達 取第8代培養的間充質干細胞，調整合適的間充質干細胞培養密度，細胞融合40%～5%時轉染GPF綠色熒光蛋白質粒，24 h后觀察轉染效果，在轉染GPF綠色熒光蛋白質粒后48～96 h表達效果最好，質粒發光強度大、數量多，效率可達40%左右。微共聚焦發現MSCs經尾靜脈注入大鼠體內24 h后，A組大鼠肺組織內可見攜帶MSCs的綠色熒光，而B組、C組及D組均未見轉染熒光（圖4）。

圖3 大鼠肺組織病理形態（HE×100）

圖4 間充質干細胞轉染GFP質粒及大鼠肺氣腫模型肺內定植（×200）

3 討論

慢阻肺是一種全球性患病率較高的疾病，40歲以上人群，慢阻肺患病率為8.2%[5]。其患病率之高十分驚人，死亡率高，目前居全球死亡原因的第4位，經濟負擔重，已成為世界第5大負擔的疾病，由于慢阻肺的發病機制復雜，病理改變可引起氣道結構重塑、肺泡結構破壞及肺血管減少，依靠機體的自我再生能力無法達到完全的修復，導致病情進行性進展。目前慢阻肺的內科治療以抗炎、擴張支氣管、氧療、呼吸運動鍛煉及增強免疫力等來緩解患者癥狀及降低患者未來健康惡化的風險，其作用非常有限，外科肺減容術及經纖支鏡肺減容術等治療目的在于緩解癥狀和改善生活質量，二者均不能阻止病情的進行性發展。因此，如能尋找到一種有效修復氣道及肺部組織結構，從而恢復肺功能的方法，將在慢阻肺的治療上將具有里程碑式的意義。

骨髓間充質干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞。在一定條件下它可分化為心肌細胞、支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞等多個胚層來源的細胞[6-8]。而且骨髓間充質干細胞在體外易于分離、培養和擴增，免疫原性低，使其在組織工程、細胞移植、基因治療等領域具有十分廣闊的應用前景[1]。近年來許多研究表明，干細胞移植可能為某些肺部疾病的治療帶來新希望[9-13]。1995年Pereira等[14]從表達人小基因膠原酶I的轉基因鼠中分離獲得成年骨髓間充質干細胞，體外擴增、培養，再通過尾靜脈注射入受致死劑量照射的小鼠中，1～5個月后，發現肺實質、骨、軟骨細胞中都含有膠原酶I陽性的細胞，骨髓來源干細胞移植移植到博萊霉素肺纖維化小鼠體內，可產生肺泡I型細胞，并使其肺纖維化程度得到改善。目前MSCs在肺部疾病治療研究主要集中于急性肺損傷與肺間質纖維化，在慢阻肺中的研究較少，骨髓間充質干細胞是否在慢阻肺大鼠體內定植、分化呢？本研究通過全骨髓貼壁法獲得了足夠數量和活力的骨髓間充質干細胞，培養的MSCs不表達CD34和CD45，表達CD29和CD44，在一定的誘導條件下可向脂肪細胞骨細胞及軟骨細胞分化，提示成功培養MSCs。應用GFP標記的MSCs可表達綠色熒光蛋白，可應用于體內實驗。筆者應用香煙煙熏成功復制肺氣腫大鼠，觀察經尾靜脈注入的MSCs在肺氣腫大鼠肺內的生存。將轉染GFP質粒的大鼠骨髓間充質干細胞經尾靜脈輸注入肺氣腫模型大鼠體內，經快速冰凍切片發現肺氣腫模型大鼠肺內骨髓間充質干細胞有骨髓間充質干細胞定植，這與Kidds等[15]報道相一致，為MSCs治療慢阻肺提供理論基礎。

[1] Le B K，Tammik C，Rosendahl K，et al.HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells[J].Exp Hematol，2003，31（10）：890-896.

[2] Sun Y Q，Deng M X，He J，et al.Human pluripotent stemcellderived mesenchymal stem cells prevent allergic airway inflammation in mice[J].Stem Cells，2012，30（12）：2692-2699.

[3] Luo D，Yan X，Liu D，et al.Differential effects of mesenchymal stem cells on a heterogeneous cell population within lung cancer cell lines[J]. Mol Cell Biochem，2013，378（1-2）：107-116.

[4] Menge T，Zhao Y，Zhao J，et al.Mesenchymal stem cells regulate blood-brain barrier integrity through TIMP3 release after traumatic brain injury[J].Sci Transl Med，2012，4（161）：150-161.

[5] Zhong N，Wang C，Yao W，et al.Prevalence of chronic obstructive pulmonary disease in China： a large， population-based survey[J].Am J Respir Crit Care Med，2007，176（8）：753-760.

[6] Kotton D N，Ma B Y，Cardoso V，et al.Bone marrow-derived cells as progenitors of lung alveolar epithelium[J].Development，2001，128 （24）：5181-5188.

[7] Wang G，Bunnell B A，Painter R G，et al.Adult stem cells from bone marrow stroma differentiate into airway epithelial cells： potential therapy for cystic fibrosis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（1）：186-191.

[8] Gregory C A，Prockop D J，Spees J L.Non-hematopoietic bone marrow stem cells： molecular control of expansion and differentiation[J].Exp Cell Res，2005，306（2）：330-335.

[9] Yen C C，Yang S H，Lin C Y，et al.Stem cells in the lung parenchyma and prospects for lung injury therapy[J].Eur J Clin Invest，2006，36（5）：310-319.

[10] Spaeth E L，Kidd S，Marini F C.Tracking inflammation-induced mobilization of mesenchymal stem cells[J].Methods Mol Biol，2012，904（12）：173-190.

[11] Kidd S，Spaeth E，Watson K，et al.Origins of the tumor microenvironment： quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma[J].PLoS One，2012，7（2）：e30 563.

[12] Zhang W G，He L，Shi X M，et al.Regulation of transplanted mesenchymal stem cells by the lung progenitor niche in rats with chronic obstructive pulmonary disease[J].Respir Res，2014，15（5）：33.

[13] Scarritt M E，Bonvillain R W，Burkett B J，et al.Hypertensive rat lungs retain hallmarks of vascular disease upon decellularization but support the growth of mesenchymal stem cells[J].Tissue Eng Part A，2014，20（9-10）：1426-1443.

[14] Pereira R F，Halford K W，O'Hara M D，et al.Cultured adherent cells from marrow can serve as long-lasting precursor cells for bone，cartilage， and lung in irradiated mice[J].Proc Natl Acad Sci USA，1995，92（11）：4857-4861.

[15] Kidd S，Spaeth E，Dembinski J L，et al.Direct evidence of mesenchymal stem cell tropism for tumor and wounding microenvironments using in vivo bioluminescent imaging[J].Stem Cells，2009，27（10）：2614-2623.

Study on the Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Transplantation in Rats Lung Tissue with Emphysema/

HE Hua，ZHAO Zhu-xiang，ZHANG Ying.//Medical Innovation of China，2014，11（21）：026-030

Objective：To observe the situation of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rats lung tissue with emphysema.Method：34 healthy rats were randomly divided into the MSCs intervention group （the group A， 10 COPD rats， tail intravenous MSC 1×106cells/mL）， the emphysema model group（the group B， 10 COPD rats，tail intravenous the same volume PBS）， the MSC control group（the group C， 10 normal rats， tail intravenous MSCs 1×106cells/mL） and the normal control group （the group D， 10 normal rats， tail intravenous the same volume PBS）. Copy the rats emphysema model used smoke， proliferated the male SD rats MSCs by whole bone marrow culture method in vitro. The cells with GFP labeled were injected into SD emphysema rats serum， killed the rats within 24 h， got the lung tissue to rapid frozen section. The homing capacity of mesenchymal stem cells with GPF transfection in rat lung was analyzed by observing pathological section.Result：The differentiation potential of bone marrow mesenchymal stem cells were successfully developed. 99.5% marrow mesenchymal stem cells expressed CD44， 99.6% expressed CD29， 0.4% expressed CD34 and 1.0% expressed CD45 when MSCs to the fourth generation. The model of rat emphysema was made successfully. The average alveolar interval in the cigarette smoke exposure group（the group A，B） was （119.0±26.2）μm higher than the control group（the group C，D）， and the average number of alveolar was （173.9±68.3）/mm2lower than the control group. The MSCs with transfection in the rats after 24 h green fluorescent protein were observed in the group A， but not in the group B， C and D.Conclusion：The bone marrow mesenchymal stem cells can colonize in pulmonary emphysema model rats by tail intravenous injection. This may provide theoretical basis for MSCs in the treatment of COPD.

Mesenchymal stem cells； Pulmonary emphysema； Transplant

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.21.008

2014-05-20） （本文編輯：蔡元元）

廣東省科技廳研究基金資助項目（00317761120224027）

①廣州市第一人民醫院 廣東 廣州 510180

張穎

First-author’s address：The First People’s Hospital of Guangzhou City，Guangzhou 510180，China