WWOX基因在乳腺癌發生過程中的表達及其意義*

徐墨李壯侯燕妮李義強

WWOX基因在乳腺癌發生過程中的表達及其意義*

徐墨①李壯①侯燕妮①李義強①

目的：研究抑癌基因WWOX在乳腺癌發生過程中不同階段的表達及乳腺癌治療過程中的作用與意義。方法：采用免疫組化SABC法對乳腺正常組織23例、12例乳腺原位癌和45例乳腺浸潤癌組織中WWOX的蛋白表達進行分析，并結合臨床病理學資料進行研究。結果：26.1%（6/23）正常乳腺組織、50.0%（6/12）乳腺原位癌、64.4%（29/45）乳腺浸潤癌組織中WWOX基因蛋白表達降低或缺失，各期間的差異有統計學意義（P＜0.01）。WWOX在Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級乳腺浸潤癌組織分期的降低與缺失表達率分別為38.5%、61.1%和92.9%，各期間的差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：抑癌基因WWOX隨著乳腺癌發生過程不同階段中，基因表達降低或缺失逐漸升高，提示WWOX在乳腺癌發生發展過程中具有重要作用。

乳腺癌； 原位癌； WWOX基因； 抑癌基因

乳腺癌近年來發病率逐年增高，是女性常見的惡性腫瘤之一。它是一種多因素導致的疾病，自身因素、環境因素、遺傳因素都有參與其發生過程。在因子水平中抑癌基因的表達有著非常重要的作用，臨床已知的抑癌因子有P53、P63、Ki67等等。逐漸尋找并開發其抑癌機理成為腫瘤近年來發展趨勢。Ried與Bednarek等人于2000年發現的含氧化還原酶ww結構域WWOX因子（ww domain contaming oxidoreductase），WWOX因子于人類普通的染色體脆性位點，包含FRA16D上的（16q23.3-q24.1）區域近年來被廣泛認可為新的抑癌基因[1]。并且以WWOX因子的實驗及文章漸漸增多，使此位點備受關注。在多種惡性腫瘤如胃腸道癌、卵巢癌、乳腺癌等都有表達減弱或趨勢表現。目前多為腫瘤培養細胞或動物實驗研究，WWOX因子關于乳腺癌的臨床研病例究較少，本研究采用免疫組織化學SABC法檢測正常乳腺組織、乳腺原位癌組織、乳腺浸潤癌組織，以及在乳腺浸潤癌組織分期I級、II級、III級中WWOX基因的降低或缺失表達與乳腺癌發生發展的過程的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2013年1月-2014年4月本院腫瘤外科手術切除的乳腺標本，通過查閱病例選取乳腺原位癌12例、浸潤癌45例（其中病理組織學Ⅰ級16例、Ⅱ級13例、Ⅲ級16例）以及正常乳腺組織23例，被選取者為女性，均經病理科檢查確診并證實，且按國際抗癌協會標準進行分級。患者術前均無放療、化療等治療。實驗所用兔抗人WWOX單克隆抗體、DAB顯色劑購于上海越研生物科技有限公司。

1.2 免疫組化法染色 通過查閱病例選取病理科的存檔蠟塊，并切片進行HE染色，然后按SABC法操作，滴加兔抗人WWOX多克隆抗體（1：100），經室溫孵育2 h，再滴生物素標記的兔抗羊抗體，37 ℃ 25 min；滴加SABC復合物，37 ℃ 25 min。后經PBS緩沖液沖洗，DAB H2O2液顯色，復染、脫水、透明、固定。實驗步驟遵循試劑盒上說明。用已知陽性乳腺癌標本片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 染色判斷 WWOX因子為細胞漿表達染色，實驗以細胞漿染成棕黃色視為陽性，根據染色程度、范圍來判定及評分。按程度分為：分為未染色、弱染色、強染色。按范圍分為：＜30%、31%～60%、61%～100%。染色的程度乘以范圍得數為評分，染色評分為1～9（染色程度為1～3，染色范圍為1～3）。評分6～9認為是WWOX基因無表達缺失，2～5為表達降低，無染色為表達完全缺失；并且將結果重復觀察。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行處理，計數資料采用秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 WWOX基因正常在乳腺組織、原位癌及浸潤癌組織中的表達 23例正常乳腺組織中，強染色表現為74.0%（17/23）（圖1），染色降低為21.7%（5/23），染色缺失為4.3%（1/23）例。12例原位癌乳腺組織中，強染色表現為50.0%（6/12）（圖2），染色降低為33.3%（4/12），染色缺失為16.7%（2/12）例。45例浸潤癌乳腺組織中，強染色表現為35.6%（16/45）（圖3），染色降低為33.3%（15/45），染色缺失為16.7% （14/45）例。三者各期間的染色表現比較差異有統計學意義（ χ2=10.319，P=0.006），見表1。

圖1 WWOX因子于正常乳腺組織中表達（×40）

圖2 WWOX因子于原位癌組織中表達（×40）

圖3 WWOX因子于浸潤癌腺組織中表達（×100）

表1 不同組織中WWOX基因的表達 例

2.2 乳腺癌中WWOX因子與臨床病理學的關系 乳腺癌Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者中WWOX表達完全缺失的比例分別為38.5%、61.1%和92.9%，各期的差異有統計學意義（ χ2=7.190，P=0.027）。

3 討論

無論國內外乳腺癌都是一種常見的疾病，目前臨床乳腺癌仍以手術治療為主，基因程度上的損傷或缺失是腫瘤發生發展的重要條件，尤其染色體脆性基因對其更敏感。所以近些年乳腺癌早期診斷及基因層面的研究逐漸興起。WWOX基因是Ried與Bednarek等人于2000年用全基因組鳥槍法測序結合區域轉錄因子進行分離法發現的新抑癌基因在多種腫瘤如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等的發生有關[2-3]。本文中WWOX基因約在1/3的正常乳腺組織與2/3的乳腺癌組織表達降低或缺失，結合文獻報道，說明在乳腺癌的發生發展過程中WWOX基因的表達異常可能揮了重要作用。乳腺癌組織TNM分型中臨床分期與WWOX基因表達也有統計學意義，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者中WWOX表達減弱或缺失的比例38.5%、61.1%和92.9%，晚期患者WWOX的減弱或缺失表達明顯升高。結合WWOX因子在其他器官中癌癥的類似報道研究，推測抑癌基因WWOX的缺失或異常表達在乳腺癌發生和進展中起明顯作用[4-6]。且有可能成為新的臨床判斷乳腺腫瘤的指標，并對預后判斷可能有重要意義。

[1] Bednark A，Laflin K，Daniel R，et al.WWOX， anovel ww domaincontaining protein mapping to human chromo-some 16q23.3→24.1，a region frequently affected in breastcancer[J].Cancer Res，2000，60 （15）：2140-2145.

[2] Guler G，Uner A，Guler N，et al.The fragile genes FHIT and WWOX are inactivated coordinately in invasive breastcarcinoma[J].Cancer，2004，100（8）：1605-1614.

[3] Bednark A K，Keck-Waggoner C L，Daniel R L，et al.WWOX， the FRA16D gene， behaves a suppressor of tumorgrowth[J].Cancer Res，2001，61（22）：8068-8073.

[4] Nunez M I，Rosen D G，Ludes-Meyers J H，et al.WWOX protein expression varies among ovarian carcinoma histotypes and correlations with less favorable outcome[J].BMC Cancer，2005，5（1）：64-74.

[5] Kuroki T，Yendamuri S，Trapasso F，et al.The tumor suppressor gene WWOX at jFRA16D is involved in pancreatic carcinogenesis[J]. Clin Cancer Res，2004，10（7）：2459-2465.

[6] Karoki T，Trapasso F，Shiraishi T，et al.Genetic alterations of the tumor suppressor gene WWOX in esophageal squamouscell carcinoma[J].Cancer Res，2002，62（8）：2258-2260.

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.21.010

2014-05-11） （本文編輯：蔡元元）

2011年黑龍江省教育廳科研項目（2010-496）

①佳木斯大學第一附屬醫院 黑龍江 佳木斯 154003

李義強